檸檬酸廢水厭氧顆粒污泥微生物菌群結構解析

曾濤濤，廖　偉，謝水波,3，榮麗杉，李仕友，蔣小梅，馬華龍

(1.南華大學 礦業工程博士后流動站，湖南 衡陽 421001；2.污染控制與資源化技術湖南省高校重點實驗室(南華大學)，湖南 衡陽 421001；3.鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室(南華大學)，湖南 衡陽 421001)

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檸檬酸廢水厭氧顆粒污泥微生物菌群結構解析

曾濤濤1,2，廖偉2，謝水波2,3，榮麗杉2，李仕友2，蔣小梅2，馬華龍2

(1.南華大學 礦業工程博士后流動站，湖南 衡陽 421001；2.污染控制與資源化技術湖南省高校重點實驗室(南華大學)，湖南 衡陽 421001；3.鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室(南華大學)，湖南 衡陽 421001)

摘要:為揭示檸檬酸廢水生物處理過程中功能菌群作用機制，以檸檬酸工業廢水內循環厭氧反應塔(IC)中厭氧顆粒污泥為研究對象，統計顆粒粒徑分布，通過環境掃描電子顯微鏡(ESEM)觀察顆粒微觀形態結構，利用高通量測序技術分析微生物多樣性及菌群特征.結果發現，粒徑在1.0～4.0 mm的顆粒所占比例最多，為74.4%.ESEM顯示微生物分布以球形細菌為主.高通量測序得到8 397條有效序列，可劃分操作分類單元(OTU)873個，Alpha多樣性指數顯示樣品文庫覆蓋率0.936，Shannon指數為4.376，而ACE指數與Chao1指數分別為3 415.51與2 246.51，反映顆粒污泥中微生物種類與數量均較多.微生物菌群主要包括4大類，分別為可降解有機物的水解發酵菌群Paludibacter、Parabacteroides、Erysipelotrichaceae、Clostridium、Phascolarctobacterium、Aminobacterium、Saccharofermentans與Alkaliflexus(所占比例之和為24.93%)；產氫產乙酸菌群Petrimonas與Syntrophomonas(所占比例之和為34.89%)；產甲烷菌Methanosaeta(3.44%)及可耐受工業廢水毒害的微生物菌群Levilinea、Longilinea與Thermovirga(所占比例之和為14.62%).

關鍵詞:厭氧顆粒污泥；微生物菌群；高通量測序；檸檬酸廢水

檸檬酸廣泛應用于食品飲料、醫藥、化工清洗與環保等領域，在檸檬酸的生產過程中會產生大量的高濃度有機廢水，對環境造成嚴重污染，檸檬酸廢水是否有效處理直接關系著檸檬酸行業的持續發展.檸檬酸工業廢水中BOD(生化需氧量)占COD(化學需氧量)的50%左右，具有良好的可生化性，因此，較多地采用生物處理方法，反應器以內循環(IC)厭氧反應器形式為主[1].在IC反應器中，微生物主要存在于厭氧顆粒污泥中，作為廢水生物處理的主體，研究顆粒污泥中的菌群結構，有助于了解檸檬酸廢水處理過程中微生物的作用機制，提高檸檬酸廢水的處理效果.目前，裴振洪等[2]通過構建16S rDNA文庫分析了檸檬酸廢水厭氧顆粒污泥菌群結構，發現優勢菌屬為棒桿菌屬(Corynebacterium)、梭菌屬(Clostridium)、消化球菌屬(Peptococcus)與疣微菌屬(Verrucomicrobia).但由于16S rDNA克隆文庫獲得的序列有限(100條左右)，僅能夠反映有限的優勢微生物類群，很大程度上可能低估了厭氧顆粒污泥微生物的物種組成.近幾年發展的高通量測序技術可獲得足夠數量的可用序列(1萬條左右)，能夠較全面和準確地反映微生物群落結構，日趨成為解析復雜環境中微生物菌群組成和相對豐度的重要工具[3].

本文以湖南某檸檬酸廢水IC反應塔中厭氧顆粒污泥為研究對象，分析顆粒粒徑分布，應用環境掃描電子顯微鏡(ESEM)觀察厭氧顆粒污泥微觀形態，并利用高通量測序技術解析厭氧顆粒污泥微生物菌群結構特征，以期為提高檸檬酸廢水處理效果提供微生物學理論基礎.

1實驗

1.1顆粒污泥形態結構

厭氧顆粒污泥取自湖南某檸檬酸生產廠化工廢水處理的內循環(IC)厭氧塔(1 400 m3)，用蒸餾水將顆粒污泥清洗3次，在坐標紙上進行粒徑分布檢測，通過數碼相機拍攝顆粒污泥外觀.

厭氧顆粒污泥微觀結構通過環境掃描電子顯微鏡(FEI QUANTA 200)觀察.樣品預處理步驟見文獻[4]：厭氧顆粒污泥在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀，將沉淀放置-80 ℃超低溫冰箱(SANYO，MDF-U32V)冷凍24 h，取出后立即置于冷凍干燥機(Freeze Dryer，FD5-series)中真空干燥24 h，脫去水分.樣品噴金后進行觀察，并利用X-射線能譜儀(EDAX Genesis 2000)分析顆粒污泥的元素組成.

1.2高通量測序

取0.5 g顆粒污泥，通過試劑盒(E.Z.N.A Soil DNA，OMEGA)提取微生物基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組的完整性，利用Qubit2.0 DNA試劑盒檢測基因組DNA濃度.

PCR擴增所用引物為341F/805R，即CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG與GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTA

CHVGGGTATCTAATCC[5].PCR反應體系包括：DNA 模板(10 ng)，5 μL 10×Buffer，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)，341F/805R引物各0.5 μL(50 μmol/L)，0.5 μL DNA聚合酶(5 U/μL，Plantium Taq，Thermo)，添加超純水至50 μL.

同一樣品設置3個重復，PCR擴增程序如下：95 ℃預變性3 min；25個循環包含3個階段，即95，55和72 ℃下各保持30 s；72 ℃終延伸5 min.PCR產物進行瓊脂糖電泳，通過DNA膠回收試劑盒(SanPrep，上海生工)對PCR產物進行回收.

回收的PCR產物通過Qubit2.0 DNA檢測試劑盒精確定量，并添加測序標簽，通過Illumina Miseq測序平臺完成對樣品高通量測序.

1.3微生物菌群結構分析

對高通量測序所得序列進行質控(QC)，以去除不符合要求的引物序列、短片段及低質量序列.將所得序列進行相似性分析，并劃分操作分類單元(OUT，相似性大于0.97).OTU聚類采用軟件uclust(http://www.drive5.com/uclust/downloads1_1_579.html).

計算微生物Alpha多樣性指數，包括覆蓋率、豐富度指數、香農指數、ACE指數與Chao1指數.樣品文庫覆蓋率(coverage)計算公式為：C=1-N1/N，其中，N1為只含有一條序列的 OTU 數目；N為總序列數目[6].豐富度指數通過操作分類單元的個數計算，以衡量單個樣本中物種種類個數.香農指數計算公式為H=-∑Pi×lnPi，其中Pi為各種群物種數與樣本總物種數比值，結果可衡量群落異質性.ACE指數和Chao1指數均用來估計群落中含OTU數目的指數，其算法不同.Alpha多樣性分析采用軟件mothur(http://www.mothur.org/).

通過RDP classifier軟件將序列進行物種分類，選取門(phylum)、屬(genus)為分類單位，統計各分類單位對應序列數量，繪制物種豐度圖[7].

2結果與討論

2.1厭氧顆粒污泥形態結構

對顆粒污泥進行數碼照相，通過坐標紙刻度對照，在放大鏡下統計了1 345個顆粒的粒徑大小(圖1(a))，并利用Origin Pro 9.0軟件繪制粒徑分布柱狀圖，結果如圖1(b)所示.厭氧顆粒污泥為深黑球狀，呈明顯的顆粒特征.粒徑在2.0～3.0 mm的顆粒所占比例最多，達37.9%；大部分粒徑在1.0～4.0 mm，所占比例為74.4%；4～5 mm的粒徑最少，比例為4.8%.

圖1　顆粒污泥外觀與粒徑分布

對真空干燥后的厭氧顆粒污泥進行粘樣，噴金30 s.在20 kV加速電壓下，通過環境掃描電鏡(ESEM)放大5 000倍，觀察顆粒污泥微觀結構，結果如圖2(a)所示.通過EDS分析顆粒污泥微生物的元素組成及比例，結果見圖2(b).

由圖2(a)可知，顆粒污泥中分布較多直徑接近1 μm的球形菌.另外發現，細胞表面光滑、形態勻稱，表明在較高有機物濃度下，顆粒污泥內的微生物生長良好.與普通活性污泥相比，顆粒污泥對工業廢水中復雜環境的適應能力更強.Tyupa等[8]研究發現，與普通絮狀活性污泥相比，顆粒污泥抗重金屬毒害作用的能力提高50%.通過能譜分析檢測顆粒污泥中元素組成及比例，結果顯示C、O、Ca、P、N、Fe、S所占比例最高，這7種元素質量分數之和達97.01%.此外，顆粒污泥中含有少量微量元素Mg和Co.

圖2　厭氧顆粒污泥微生物形態結構

2.2微生物群落結構解析

2.2.1樣本序列

測序獲得原始序列10 392條，去除barcode序列、兩端引物序列，并進行質控以去除部分低質量序列、嵌合體及靶區域外序列，得到可用于分析的8 397條序列，這些序列平均長度為414.3 bp(表1).表明顆粒污泥具備較大的樣本序列數量且平均長度合適，可很好地滿足后續微生物多樣性分析要求.

表1　污泥測序序列分析結果

2.2.2微生物多樣性分析

微生物Alpha多樣性指數結果如表2所示.隨機抽取樣本序列數作為橫坐標，以對應的OTU數目為縱坐標，可繪制出如圖3(a)所示的豐富度稀疏曲線.同理，得到香農指數曲線(圖3(b))、ACE指數曲線(圖3(c))與Chao1指數線(圖3(d)).

表2　顆粒污泥微生物Alpha多樣性統計

試驗獲得的8 397條序列可分成873個OTU，而操作分類單元可能接近于屬，表明顆粒污泥中微生物種類很多.樣本覆蓋率達0.936，對應圖3(a)豐富度稀疏曲線，說明序列沒有被測出的概率非常小，該結果能很好地反映顆粒污泥中微生物實際存在情況.Shannon指數為4.376，對應圖3(b)中的Shannon指數曲線最終趨向平坦，說明取樣的數量合理，取樣深度足夠.另外，ACE指數達3 415.51，Chao1指數為2 246.51，這兩個指數常用來估計物種總數.對應圖3(c)、(d)這2條曲線也能反映出序列數量達到或接近飽和，表面顆粒污泥中微生物多樣性極高.由此說明，在檸檬酸化工廢水處理過程中，顆粒污泥保持較高的微生物豐度與菌屬多樣性.

圖3　物種多樣性分析

2.2.3微生物菌群結構解析

通過RDP classifier軟件分析phylum(門)水平各微生物所占比例，小于0.3%的細菌統一用“Other”表示，結果如圖4所示.可以看出，微生物主要可分為7大類門，豐度最高的是擬桿菌門(Bacteroidetes)，比例達43.13%；其次為厚壁菌門(Firmicutes)，比例為24.83%.綠彎菌門(Chloroflexi)為顆粒污泥中第3大類微生物，比例為16.03%.接下來依次為廣古菌門(Euryarchaeota)、變形菌門(Proteobacteria)、互養菌門(Synergistetes)及嗜熱絲菌門(Caldiserica)，所占比例分別為3.73%、2.56%、2.2%及0.38%.另外，未分類到具體細菌門的序列(unclassified)所占比例為5.64%，還有其他一些數目非常低的細菌門(比例小于0.3%)，其比例之和為1.5%.

為了更清楚了解厭氧顆粒污泥的菌屬特征，分析了屬(genus)水平對應的序列數量及其所占比例，并繪制菌屬豐度柱狀圖，結果如圖5所示.對于所占比例小于0.5%的物種統一用“Other”表示.

圖4　Phylum水平上微生物豐度圖

由圖5可知，Petrimonas(理研菌屬)所占比例為32.14%，包含序列2 699條，為顆粒污泥中含量最多的微生物菌屬.Petrimonas具有厭氧發酵產氫能力，這與厭氧顆粒污泥性質密切相關，是厭氧處理高濃度有機廢水的功能菌屬.Petrimonas曾在微生物燃料電池中出現[9]，與產甲烷菌分別參與產氫和產甲烷過程.Erysipelotrichaceae菌的豐度為7.68%，包含相應序列645條.之前研究發現Erysipelotrichaceae參與乳酸代謝過程[10]，檸檬酸生產廢水中有機酸類主要為乳酸，因此，顆粒污泥中的該類微生物可有效地將乳酸進行分解.

Paludibacter和Parabacteroides菌屬所占比例分別為7.17%與0.69%，均屬于專性厭氧的擬桿菌門.研究發現，擬桿菌屬能發酵多種單糖和二糖產生丙酸、乙酸和少量丁酸[11]，因此，這兩類微生物也是厭氧顆粒污泥中的功能菌屬.Clostridium(梭菌屬)所占比例為5.95%，包含序列500條，是顆粒污泥優勢菌屬之一.Clostridium屬于厚壁菌門(Firmicutes)，是重要的酸化發酵菌，降解有機物產生甲酸、乙酸、丙酸等揮發酸，之前裴振洪等[2]通過16S rDNA文庫方法，分析了檸檬酸廢水厭氧顆粒污泥群落結構，同樣發現梭菌屬是其優勢菌屬.Syntrophomonas(互營單胞菌)在顆粒中所占比例為2.75%，包含序列231條.該菌屬是厭氧發酵中常見的微生物，可以降解丁酸，為顆粒污泥功能菌屬之一.周軒宇[12]研究了處理造紙廢水的新型厭氧反應器內功能菌群，發現Syntrophomonas所占比例最高時達(20.76±0.51)%，是主要的優勢菌群，對造紙廢水容積負荷波動具有良好的抗沖擊性.

圖5　Genus水平上物種豐度圖

Methanosaeta(甲烷鬃菌屬)所占比例為3.44%，包含序列289條，是顆粒污泥進行廢水厭氧消化產甲烷階段的功能菌屬.朱文秀等[13]進行了IC反應器處理啤酒廢水的效能及其微生物群落動態分析，發現Methanosaeta在高進水負荷下優勢地位顯著，表明這類產甲烷菌具有耐受高負荷性能.Phascolarctobacterium屬于厚壁菌門(Firmicutes)，在顆粒污泥中所占比例為1.63%，包含序列137條，具有厭氧發酵產生短鏈脂肪酸的能力[14].

Levilinea(11.42%)和Longilinea(2.2%)為厭氧繩菌綱(Anaerolineae)的典型微生物菌屬.曹新塏等[15]發現Levilinea存在于處理含萘工業廢水的厭氧活性污泥中；王學華等[16]也發現Levilinea、長繩菌屬(Longilinea)是處理印染廢水UASB反應器內的優勢菌屬.因此，Levilinea與長繩菌屬(Longilinea)均具有耐受工業廢水中有毒物質侵害的能力.Thermovirga所占比例為1%，包含序列84條.王有昭[17]進行了生物電化學強化偶氮染料脫色作用機制研究，發現Thermovirga在耐毒性馴化后的陽極生物膜中所占比例為15.9%，在強化偶氮染料還原脫色中發揮關鍵作用，該菌屬的存在有助于提高顆粒污泥對工業廢水中有毒物質的耐受性能.

Aminobacterium、Saccharofermentans與Alkaliflexus3種菌屬所占比例較低，分別為0.68%、0.61%與0.52%，這3類菌曾在秸稈發酵液微生物菌群分析中觀察到.其中Aminobacterium參與氨基酸代謝，Alkaliflexus具有纖維素降解功能，可提供底物給產酸菌[18].

此外，測序結果中有1 129條序列與已有菌屬相似性低，不能歸為其中一類，用Unclassified bacteria(未明確分類細菌)表示，所占比例為13.45%，這些序列的作用有待深入研究.所有比例低于0.5%的序列之和為727條，對應菌屬豐度共占8.67%.說明顆粒污泥中還存在許多低豐度微生物菌屬，雖不屬于優勢菌群，但也是顆粒污泥菌群結構的重要組分.

從以上分析可知，厭氧顆粒污泥功能菌群包括4大類，分別為有機物水解發酵菌群Paludibacter、Parabacteroides、Erysipelotrichaceae、Clostridium、Phascolarctobacterium、Aminobacterium、Saccharofermentans與Alkaliflexus(所占比例之和為24.93%)；產氫產乙酸菌群Petrimonas與Syntrophomonas(所占比例之和為34.89%)；產甲烷菌Methanosaeta(3.44%)及可耐受工業廢水毒害的微生物菌群Levilinea、Longilinea與Thermovirga(所占比例之和為14.62%).由多種功能菌群組成厭氧顆粒污泥群落結構，可有效地完成高濃度檸檬酸廢水處理及抵抗有害物質對微生物的毒害作用.

3結論

1)厭氧顆粒污泥可揮發性懸浮固體濃度(VSS)所占比例較高(0.611)，大部分顆粒粒徑在1.0～4.0 mm(74.4%).ESEM顯示顆粒污泥中存在大量直徑約1 μm的球形細菌；EDS結果表明C、O、Ca、P、N、Fe、S這7種元素所占質量分數最高.

2)高通量測序獲得8 397條有效序列，可劃分操作分類單元(OTU)873個，Alpha多樣性指數顯示樣品文庫覆蓋率為0.936，Shannon指數為4.376，而ACE指數與Chao1指數分別為3 415.51與2 246.51，各自對應的曲線趨向平坦，反映出顆粒污泥中微生物多樣性與豐富度均較高.

3)厭氧顆粒污泥功能菌群包括4大類，分別為有機物水解發酵菌群Paludibacter、Parabacteroides、Erysipelotrichaceae、Clostridium、Phascolarctobacterium、Aminobacterium、Saccharofermentans與Alkaliflexus(所占比例之和為24.93%)；產氫產乙酸菌群Petrimonas與Syntrophomonas(所占比例之和為34.89%)；產甲烷菌Methanosaeta(3.44%)及可耐受工業廢水毒害的微生物菌群Levilinea、Longilinea與Thermovirga(所占比例之和為14.62%).

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(編輯劉彤)

doi：10.11918/j.issn.0367-6234.2016.08.019

收稿日期:2015-07-26

基金項目:國家自然科學基金(51408293);中國博士后基金面上項目(2014M562114);湖南省教育廳優秀青年項目(14B154)

作者簡介:曾濤濤(1985—)，男，博士，講師; 謝水波(1964—)，男，教授，博士生導師

通信作者:謝水波，xiesbmr@263.net

中圖分類號:X172

文獻標志碼:A

文章編號:0367-6234(2016)08-0115-06

Analysis of bacterial community in anaerobic granular sludge for citric acid wastewater treatment

ZENG Taotao1,2, LIAO Wei2, XIE Shuibo2,3, RONG Lishan2, LI Shiyou2, JIANG Xiaomei2, MA Hualong2

(1.Postdoctoral Research Centre of Mining Engineering，University of South China, Hengyang 421001,Hunan,China；2.Hunan Province Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse Technology(University of South China), Hengyang 421001, Hunan,China；3.Key Discipline Laboratory for National Defence for Biotechnology in Uranium Mining and Hydromentallurgy (University of South China), Hengyang 421001, Hunan,China)

Abstract:To clarify the performance of functional microorganisms involved in biological citric acid wastewater treatment systems, bacterial community structure of anaerobic granular sludge was investigated in an internal circulation (IC) anaerobic reactor treating citric acid industry wastewater. Microstructure observation was carried out by environmental scanning electron microscope (ESEM), and the microbial diversity and microfloras were analyzed by high-throughput sequencing. Particle size distribution results showed that the most particles’ diameters ranged from 1.0 mm to 4.0 mm (accounted for 74.4%). ESEM results showed that spherical bacteria were the dominant microorganisms in granular sludge. The total dataset comprised 8 397 high quality sequences, which could be subdivided into 873 operational taxonomic units. A library coverage of 0.936 implied that the granular sludge exhibited a high microbial diversity and abundance. The Shannon index, ACE index and Chao1 index were 4.376, 3 415.51 and 2 246.51, respectively. Genus classification revealed that there were four typical bacterial groups: hydrolytic fermentative bacteria for organic matter degradation were closely related to Paludibacter, Parabacteroides, Erysipelotrichaceae, Clostridium, Phascolarctobacterium, Aminobacterium, Saccharofermentans and Alkaliflexus, which accounted 24.93% of the bulk bacterial; H2-producing and acetogenic bacteria were correlated with Petrimonas and Syntrophomonas, which accounted for 34.89%; methanogens of Methanosaeta accounted 3.44%; and the microflora groups of Levilinea, Longilinea and Thermovirga could be capable of tolerating toxic industrial wastewater, accounting for 14.62% instead.

Keywords:anaerobic granular sludge; microbial community; high-throughput sequencing; citric acid wastewater