采后亞硒酸鈉處理對杏果黑斑病的控制及貯藏品質(zhì)的影響

高春麗，李永才*，畢 陽，劉 筱，楊 蘭，喬文景，王 迪，唐 瑛（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

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采后亞硒酸鈉處理對杏果黑斑病的控制及貯藏品質(zhì)的影響

高春麗，李永才*，畢 陽，劉 筱，楊 蘭，喬文景，王 迪，唐 瑛
（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

通過離體和體內(nèi)實驗研究亞硒酸鈉對杏果黑斑病菌互隔交鏈孢（Alternaria alternata）的抑制作用及黑斑病的控制效果和貯藏品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，亞硒酸鈉處理能顯著抑制A.alternata菌落的生長和孢子萌發(fā)，且存在質(zhì)量濃度效應(yīng)，40 mg/L的亞硒酸鈉能顯著抑制A.alternata菌落的生長，其菌落直徑較對照降低了30.8%，同時亞硒酸鈉還能使A.alternata菌絲發(fā)生凹陷、扭曲等形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；體內(nèi)實驗表明，采后亞硒酸鈉處理能有效抑制損傷接種A.alternata的杏果黑斑病的擴(kuò)展，其中20 mg/L亞硒酸鈉的控制效果最佳，其病斑直徑較對照減小了11%；采后亞硒酸鈉處理還能夠明顯減少杏果乙烯的釋放和呼吸強(qiáng)度的升高，延緩質(zhì)量損失率和硬度的降低。可見硒在果蔬采后防腐保鮮中具有潛在的應(yīng)用前景。

亞硒酸鈉；杏果；黑斑病；抑菌特性；貯藏品質(zhì)

杏果（Armeniaca vulgaris）色澤鮮艷、芳香濃郁、甜酸適口、營養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛［1］。但杏果采后易受機(jī)械損傷、貯藏期短，尤其易受根霉、互隔交鏈孢等病原菌侵染而發(fā)病，其中以互隔交鏈孢（Alternariaalternata）引起的黑斑病尤為嚴(yán)重，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。且A.alternata是果蔬采后的常見病原物，可引起蘋果梨、甜椒、柑橘、杏等多種果蔬產(chǎn)生黑斑［2］。雖然可通過使用人工合成殺菌劑進(jìn)行病害控制，但由于人工合成殺菌劑長期使用會造成環(huán)境污染、病原菌抗病性和農(nóng)藥殘留問題。因此，開發(fā)杏果采后安全的防腐劑已勢在必行。

1973年，世界衛(wèi)生組織和國際營養(yǎng)組織確認(rèn)硒為人和動物體內(nèi)必需的微量元素，主要是通過蛋白質(zhì)特別是與酶蛋白結(jié)合發(fā)揮抗氧化作用。硒是谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶的組分［3］，適量的硒在一定程度能提高植物體的抗氧化作用［4-5］，在人體調(diào)節(jié)免疫、抵制病毒突變、防治癌癥的發(fā)生等方面也起著十分重要的作用［6-7］。近期調(diào)查發(fā)現(xiàn)在某些含硒量高的地區(qū)癌癥發(fā)病率較低，因此各種富含硒的食品受到廣泛的青睞。但高濃度硒會對植物產(chǎn)生毒害作用［8-10］；對部分生物體來說，硒缺乏、必需和毒害劑量間的差異非常小［11-13］。很多研究證實低濃度亞硒酸鹽對植物生長有促進(jìn)作用，而高濃度則抑制其生長［14］。王文舉等［15］研究表明，噴施亞硒酸鈉溶液的葡萄植株能夠提高葡萄果實的耐熱性，改善成熟葡萄果實的品質(zhì)。劉樹梅等［16］研究表明，葉面噴施適宜量的亞硒酸鈉能明顯提高果實可溶性固形物（total soluble solid，TSS）和含硒量，且杏樹的適宜使用量為30 mg/kg時，果實TSS含量達(dá)11.3%，果實含硒量為13.0 μg/kg。近期研究還發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉能夠顯著抑制Penicillum expansum孢子萌發(fā)、芽管伸長及菌絲生長，且抑制效果與硒的濃度呈正相關(guān)［17］，表明硒可能作為一個潛在的替代合成殺真菌劑控制蘋果采后青霉病。但有關(guān)硒對采后病原物抑制的廣譜性及其機(jī)理的系統(tǒng)研究鮮見報道。

本研究以蘭州大接杏為材料，研究亞硒酸鈉對杏果黑斑病菌A.alternata的抑制作用及亞硒酸鈉處理對杏果采后生理及貯藏品質(zhì)的影響，以期為硒在采后果蔬防腐保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

供試蘭州大接杏于2015年7月購于蘭州市安寧區(qū)桃海市場，剔除病果傷果，選擇大小、果色均勻且成熟度一致的果實，紙箱包裝后當(dāng)天運(yùn)抵實驗室進(jìn)行處理。

供試菌株為A.alternata，分離于自然發(fā)病果實，純化后馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上保存待用。

亞硒酸鈉（分析純） 上海中秦化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；WYT-32型手持折光儀 廈門中村光學(xué)儀器廠；GXH-3051H型果蔬呼吸儀 北京均方理化科技研究所；S3400N型掃描電子顯微鏡 日本日立高新技術(shù)有限公司；7820A型氣相色譜儀 美國Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制作

參照方中達(dá)［18］方法進(jìn)行。PDA培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。將200 g馬鈴薯削皮后切成1 cm3體積的小塊，加水煮沸30 min后4 層紗布過濾并定容至1 000 mL，然后將一定量瓊脂和蔗糖分別與馬鈴薯過濾液混合，分裝在三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌，制備PDA平板。

1.3.2 病原菌分離、純化與鑒定

參照李永才［19］的方法進(jìn)行。采集黑斑病病果，用75%酒精表面消毒，再用無菌水沖洗后切取病健交界組織，在無菌操作條件下移至PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃保溫培養(yǎng)，待長出分生孢子之后進(jìn)行分離、純化，分離純化后的菌種要經(jīng)過侵染回接實驗才能認(rèn)定其致病性。將各分離純化后的菌株回接到杏果上，如果發(fā)病癥狀與貯藏時出現(xiàn)的病癥相符合，方可作為采后病害病原菌進(jìn)一步鑒定到屬種，鑒定后在PDA培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 孢子懸浮液的配制

參照劉紅霞等［20］的方法并修改，在進(jìn)行分離、純化、鑒定后培養(yǎng)7 d的A.alternata中各倒入少量無菌水，加入少量0.01% Tween-80，用滅過菌的涂布棒輕刮，并通過4 層紗布過濾到三角瓶中，用無菌水稀釋，在混合器上振蕩15 s，用血球計數(shù)板計數(shù)，配制成106CFU/mL孢子懸浮液。

1.3.4 亞硒酸鈉對A.alternata菌落生長的影響

參照范青等［21］的方法進(jìn)行并作修改。分別取15 mL含有0、5、10、20、40 mg/L亞硒酸鈉的PDA培養(yǎng)基（以每1 L計），將其均勻平鋪在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，以不加藥物的PDA為對照，待平板冷卻后分別將純化的A.alternata菌餅（直徑8 mm）接于培養(yǎng)皿中央，28 ℃避光培養(yǎng)。當(dāng)對照培養(yǎng)皿中的菌斑長滿培養(yǎng)皿時，測定各處理菌落直徑。上述實驗重復(fù)3 次。并參照吳慧昊等［22］方法計算其抑菌率。

1.3.5 亞硒酸鈉對A.alternata孢子萌發(fā)的影響

打孔器采用酒精燈火焰法滅菌后，打孔取水瓊脂餅（2%的瓊脂溶液滅菌后倒入9 cm的培養(yǎng)皿中，待冷卻），置于無菌載玻片上，向水瓊脂餅上滴加10 μL質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、40 mg/L的亞硒酸鈉溶液，再在其上加10 μL 1×106個/mL振蕩均勻的A.alternata孢子懸浮液，于25 ℃在光學(xué)顯微鏡下連續(xù)數(shù)鏡檢孢子萌發(fā)率，直至對照組完全萌發(fā)（芽管長度大于或等于孢子最短徑的一半時認(rèn)為其萌發(fā)），每個處理3 次重復(fù)。

1.3.6 亞硒酸鈉對A.alternata菌落形態(tài)的影響

參照高向陽等［23］的方法。將含有20 mg/L亞硒酸鈉的培養(yǎng)基上生長7 d的菌絲塊（0.5 cm×0.5 cm）及對照菌絲塊用體積分?jǐn)?shù)2%戊二醛溶液固定，于4 ℃放置2 h；經(jīng)乙醇系列梯度（50%、70%、95%、100%）處理10 min，醋酸異戊酯置換乙醇20 min。脫水樣品進(jìn)行臨界點干燥，真空噴金。在掃描電子顯微鏡下觀察制好的樣品并拍照。

1.3.7 亞硒酸鈉對損傷接種杏果黑斑病的抑制

參照Moscoso-Ramírez等［24-25］的方法。選擇大小、果色均勻一致、無傷病的果實用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，清水沖洗，晾干，用70%酒精進(jìn)行果實表面消毒，然后用滅菌鐵釘（直徑3 mm）在果實赤道部位均勻刺孔2 個，每孔中注入1×106個/mL A.alternata孢子懸浮液10 μL，接種2 h后在刺孔中各接入等質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、40 mg/L亞硒酸鈉溶液。晾干后用市售聚乙烯保鮮袋（25 mm×40 mm，厚度0.02 mm）包裝，在30 ℃條件下貯藏，7 d后用十字交叉法測定病斑直徑，每處理用果10 個。

1.3.8 生理指標(biāo)的測定

選擇大小、果色均勻一致、無傷病、未經(jīng)處理的果實用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，清水沖洗后，分別在0、5、10、20、40 mg/L亞硒酸鈉溶液浸泡5 min，以蒸餾水浸泡處理作對照，取出后在室溫條件下晾干，市售聚乙烯保鮮袋（25 mm×40 mm，厚度0.02 mm）包裝，30 ℃條件下貯藏。每處理用果6 個，3 次重復(fù)。

1.3.8.1 質(zhì)量損失率的測定

采用稱量法。每個處理用果實6 個，重復(fù)3 次。

1.3.8.2 呼吸強(qiáng)度的測定

參照寇曉紅等［26］方法，采用果蔬呼吸儀進(jìn)行測定。氣體流速500 mL/min。各處理用果實6 個，重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.8.3 果實乙烯釋放量的測定

取0.5 kg果實放入2 L干燥器中密封4 h，抽取1 mL混合氣體注入氣相色譜儀測定乙烯釋放量。乙烯釋放量分析條件：DM-5色譜柱，汽化室溫度1200 ℃，柱溫60 ℃，氫氣壓力0.7 kg/cm2，空氣壓力0.7 kg/cm2，氮?dú)鈮毫?.0 kg/cm2，氫火焰離子化檢測器檢測，檢測室溫度150 ℃，單位為μL/（kg·h）。

1.3.9 品質(zhì)指標(biāo)的測定

1.3.9.1 TSS含量的測定

采用手持折光儀進(jìn)行測定。果實最大直徑處均勻選3 個點測定，每個處理用果實6 個，重復(fù)3 次。

1.3.9.2 硬度的測定

果實硬度使用果蔬硬度計測定。果實最大直徑處去皮后均勻選3 個點測定，每個處理用果實6 個，每處理重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010計算標(biāo)準(zhǔn)偏差并作圖，并用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行Duncan's多重差異顯著分析。圖中豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤，相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 亞硒酸鈉處理對A.alternata菌絲生長的影響

圖1 亞硒酸鈉處理對 A.a lter nata 菌絲生長的影響Fig.1 Effect of sodium selenite treatment on mycelial growth of A.alternata

由圖1可知，亞硒酸鈉能顯著地抑制A.alternata的菌絲生長（P＜0.05），且隨著處理質(zhì)量濃度的增加，抑菌作用越明顯。其中40 mg/L的亞硒酸鈉抑菌效果最好，培養(yǎng)7 d后其菌落直徑僅為5.55 cm，較對照降低了30.8%，抑菌率達(dá)到了52%。

2.1.2 亞硒酸鈉處理對A.alternata孢子萌發(fā)的影響

圖2 亞硒酸鈉處理對 A.a lter nata 孢 子萌發(fā)的影響Fig.2 Effect of sodium selenite treatment on spore germination of A.alternata

由圖2可知，A.alternata孢子萌發(fā)率均隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增大，在2 h時，高質(zhì)量濃度亞硒酸鈉處理刺激了孢子的萌發(fā)，但隨時間的延長則呈現(xiàn)抑制作用。6 h時對照組孢子萌發(fā)率已高達(dá)95.33%，而20 mg/L的亞硒酸鈉處理組為85.7%，較對照組降低了10.1%。

2.1.3 亞硒酸鈉處理對A.alternata菌絲形態(tài)的影響

圖3 亞硒酸鈉處理對 A.alterna ta 菌絲形態(tài)的影響Fig.3 Effect of sodium selenite treatment on mycelial morpholgy of A.alternata

通過掃描電子顯微鏡圖片發(fā)現(xiàn)，與對照（圖3A）相比亞硒酸鈉處理后菌絲折疊扭曲盤繞（圖3B），進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉處理菌絲明顯脫水扭曲，且孢子也皺縮、塌陷（圖3D），而對照A.alternata孢子較為飽滿，菌絲均勻一致（圖3C）。

2.1.4 亞硒酸鈉處理對杏果黑斑病的控制

圖4 亞硒酸鈉處理對杏果黑斑病的控制Fig.4 Controlling effect of sodium selenite treatment on apricot fruit black spot

由圖4可知，亞硒酸鈉處理對杏果黑斑病的擴(kuò)展具有一定的控制效果，隨質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先下降后驟然升高的現(xiàn)象。其中20 mg/L的抑菌效果最顯著，病斑直徑比對照減小了11%，而40 mg/L的亞硒酸鈉處理病斑直徑反而增大，這可能是高質(zhì)量濃度亞硒酸鈉處理對杏果造成了藥害。

2.2 亞硒酸鈉處理對杏果貯藏品質(zhì)及生理特性的影響

2.2.1 對呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量的影響

乙烯釋放量呈先上升后下降的趨勢，總體上亞硒酸鈉處理能有效減少杏果乙烯的釋放量（圖5A）。當(dāng)貯藏到第6天時乙烯釋放量達(dá)到了最大值，其中20 mg/L的亞硒酸鈉處理能夠明顯減少乙烯的釋放，較對照組降低了18.6%。

圖5 亞硒酸鈉處理對杏果乙烯釋放量（A）和呼吸強(qiáng)度（B）的影響Fig.5 Effect of sodium selenite treatment on ethylene release （A） and respiration intensity （B） in apricot fruit

由圖5B可知，貯藏期間杏果呼吸強(qiáng)度呈先上升后下降的趨勢，處理組呼吸強(qiáng)度均低于對照。貯藏8 d時達(dá)到了呼吸高峰，此時對照組呼吸強(qiáng)度高達(dá)38.97 mg CO2/（kg·h），而20 mg/L的亞硒酸鈉處理組僅為為26.01 mg CO2/（kg·h），較對照降低了33.26%，但亞硒酸鈉處理對于呼吸高峰的出現(xiàn)時間沒有影響（圖5B）。

2.2.2 對杏果質(zhì)量損失率的影響

圖6 亞硒酸鈉處理對杏果質(zhì)量損失率的影響Fig.6 Effect of sodium selenite treatment on weight loss of apricot fruit

由圖6可知，果實質(zhì)量損失率隨貯藏時間的延長逐漸增大，處理后的果實質(zhì)量損失率低于對照，但當(dāng)亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度為40 mg/L時，卻顯著高于對照。貯藏到第8天亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為20 mg/L時，杏果實的質(zhì)量損失率最小，較對照降低了34.9%。

2.2.3 對TSS含量和硬度的影響

由圖7A可知，杏果TSS含量隨貯藏時間的延長總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，亞硒酸鈉處理增加了杏果TSS含量，貯藏到第8天時對照與20 mg/L亞硒酸鈉溶液處理后果實的TSS含量分別為7.28%、7.63%。

圖7 亞硒酸鈉處理對杏果TSS含量（A）和硬度（B）的影響Fig.7 Effect of sodium selenite treatment on total soluble solids content （A） and firmness （B） in apricot fruit

由圖7可知，果實硬度在貯藏期間迅速下降，且40 mg/L亞硒酸鈉處理在貯藏后期明顯地延緩了果實硬度的降低，其硬度比對照高10%。

3 討論與結(jié)論

硒作為人體重要的微量元素具有提高人體免疫力、抗氧化抗衰老、參與糖尿病的治療、防癌抗癌、保護(hù)眼睛、保護(hù)修復(fù)細(xì)胞、防治心血管類疾病等多種功效。本實驗發(fā)現(xiàn)20 mg/L的亞硒酸鈉處理能顯著抑制A.alternata孢子萌發(fā)及菌落生長，這與Wu Zhilin等［17］在P.expansum上的研究一致，其結(jié)果表明硒還具有抑菌特性，同時還發(fā)現(xiàn)硒處理不僅能夠顯著降低P.expansum孢子細(xì)胞膜的完整性，而且誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧（H2O2、O2-）產(chǎn)生、降低超氧化物歧化酶的活性，可見硒可能是通過影響病原物細(xì)胞膜及胞內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)而抑制病原物的生長，但其具體的作用機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

微量的硒是許多生物體必需的一種微量營養(yǎng)素，包括人類和其他動植物［27］。低濃度的硒能增強(qiáng)植物的抗菌及抗氧化特性［14］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)硒處理不僅能抑制杏果黑斑病的擴(kuò)展，而且能夠明顯減少杏果乙烯的釋放和呼吸強(qiáng)度的升高、延緩質(zhì)量損失率和硬度的降低，可見硒在果蔬采后防腐保鮮中具有潛在應(yīng)用前景，但有關(guān)其作用機(jī)理及采后規(guī)范化的處理技術(shù)尚需進(jìn)一步研究。

綜合以上，亞硒酸鈉處理能顯著地抑制A.alternata菌落生長和孢子萌發(fā)，同時還能使A.alternata菌絲發(fā)生凹陷、扭曲等形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。采后亞硒酸鈉處理能夠有效地抑制杏果黑斑病的擴(kuò)展，20 mg/L亞硒酸鈉抑制效果最顯著，病斑直徑較對照減小了11%。亞硒酸鈉處理能夠抑制杏果乙烯的釋放量和呼吸強(qiáng)度的升高、延緩質(zhì)量損失率和硬度的降低，有效地保持杏果的貯藏品質(zhì)。

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Effects of Sodium Selenite Treatment on Black Spot Disease and Storage Quality of Postharvest Apricot Fruit

GAO Chunli， LI Yongcai*， BI Yang， LIU Xiao， YANG Lan， QIAO Wenjing， WANG Di， TANG Ying
（College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Effects of sodium selenite on the in vitro and in vivo growth of Alternaria alternata， the causal agent of black rot disease in vitro， disease development and storage quality of apricot fruit were investigated.The results showed that mycelial growth and spore germination of A.alternata were significantly （P ＜ 0.05） inhibited by sodium selenite treatment，and the optimal inhibitory effect was achieved at a concentration of 40 mg/L.Additionally， sodium selenite treatment caused changes in the morphological structure of A.alternata mycelia such as sunken and distorted hyphae as observed by scanning electron microscopy （SEM）， with a 30.8% reduction observed in its colony diameter as compared to the control.In vivo experiments showed that the lesion expansion of apricot fruit inoculated with A.alternata was effectively inhibited by treatment with 20 mg/L sodium selenite.In addition， the ethylene release and respiration intensity of apricot fruit were significantly reduced while the reductions of weight loss and firmness were delayed.These findings suggested that selenium has potential application in disease control and preservation of postharvest fruits and vegetables.

sodium selenite； apricot fruit； black rot； antifungal activity； storage quality

10.7506/spkx1002-6630-201614047

TS201.3

A

1002-6630（2016）14-0258-06

高春麗， 李永才， 畢陽， 等.采后亞硒酸鈉處理對杏果黑斑病的控制及貯藏品質(zhì)的影響［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 258-263.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614047. http://www.spkx.net.cn

GAO Chunli， LI Yongcai， BI Yang， et al.Effects of sodium selenite treatment on black spot disease and storage quality of postharvest apricot fruit［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 258-263.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614047. http://www.spkx.net.cn

2015-11-17

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)青年導(dǎo)師基金項目（GAU-QNDS-201208）

高春麗（1990—），女，碩士研究生，研究方向為采后果蔬貯藏與保鮮。E-mail：gaochunli1214@sina.com

*通信作者：李永才（1972—），男，副教授，博士，研究方向為采后果蔬貯藏病害控制。E-mail：liyongcai@gsau.edu.cn