枯草芽胞桿菌TR21激發的廣粉1號根系抗性信號物質累積

張 琳，程 萍，喻國輝，王 燕，3

（1.仲愷農業工程學院生命科學學院，廣東 廣州 510225；2.珠海市現代農業發展中心，廣東 珠海 519075；3.華中農業大學生命科學技術學院，湖北 武漢 430070）

枯草芽胞桿菌TR21激發的廣粉1號根系抗性信號物質累積

張 琳1，2，程 萍1，2，喻國輝2，王 燕2，3

（1.仲愷農業工程學院生命科學學院，廣東 廣州 510225；2.珠海市現代農業發展中心，廣東 珠海 519075；3.華中農業大學生命科學技術學院，湖北 武漢 430070）

通過檢測廣粉1號根系中與抗性途徑有關的信號物質NO、H2O2和SA含量變化，揭示枯草芽胞桿菌TR21菌株誘導的粉蕉系統抗性與SAR途徑的關系。試驗設置清水（CK）、TR21葉腋接種、香蕉枯萎病菌FOC004菌株根系接種和挑戰接種（TR21葉腋接種24 h后再根系接種FOC004）4種方式處理廣粉1號種苗，測定4種方式接種后0、12、24、48、72、96 h 根系SA、NO、H2O2含量。結果顯示：TR21處理和FOC004處理均在早期避免激活植物產生NO，而挑戰處理則迅速激活植物根系產生NO并持續維持高水平；TR21處理和FOC004處理也在早期避免迅速激活植物產生H2O2，FOC004處理在24 h才顯著激發植物根系H2O2含量升高，而TR21處理需要到48 h才使根系H2O2達到最高，但挑戰處理在12 h就顯著激發了植物根系的H2O2，并一直維持較高水平；TR21處理早期顯著激發植物根系游離SA的產生并避免植物產生結合態SA，FOC004處理則抑制植物根系在應答早期產生游離態和結合態SA，挑戰處理主要激發植物長期穩定高水平產生結合態SA。試驗表明，TR21葉腋接種的確可以激發廣粉1號后期快速應答病原菌的入侵，對TR21進一步開發和大田生產應用具有意義。

香蕉枯萎病；枯草芽胞桿菌；誘導抗性；信號物質

張琳，程萍，喻國輝，等.枯草芽胞桿菌TR21激發的廣粉1號根系抗性信號物質累積［J］.廣東農業科學，2016，43（5）：101-106.

香蕉枯萎病又稱巴拿馬病，是由尖孢鐮刀菌古巴?；鸵鸬耐羵骶S管束病害，給香蕉生產帶來了極大危害，其預防和控制成為一個世界性難題，受到各國學者的廣泛關注［1-4］。香蕉枯萎病的防治措施包括化學防治、農業防治、生物防治和抗性育種等，其中除抗性育種取得了較好的進展，并已在生產中推廣使用，利用生物防治技術開展香蕉枯萎病防控也取得了較好的進展［5-6］，尤其以枯草芽胞桿菌TR21（Bacillus subtilis TR21）的研究和應用為代表。該菌株是一株廣譜抗真菌植物內生菌，能夠在香蕉根系和球莖內定殖，誘導香蕉產生系統抗性［7-10］，利用誘導抗性可以在大田防治巴西蕉枯萎病［11］。

Bai等［12］對香蕉轉錄組開展的研究發現，抗病品種主要通過水楊酸介導的系統獲得抗性（SAR）防御枯萎病的入侵。Wang等［13］對農科1號和巴西蕉受到病原菌入侵后涉及水楊酸途徑的相關基因開展實時熒光定量檢測，進一步證實水楊酸介導的SAR參與農科1號對枯萎病的防御。當植物受到病原菌侵染時，早期應答會引起鈣離子流、活性氧迸發和NO產生，并引起SA水平顯著上升從而激活植物系統免疫反應以防御病原菌入侵［14-19］。H2O2是植物產生的最穩定的活性氧，大量積累除能直接毒殺植物體內病原菌，還能作為植物應對外界環境脅迫的信號分子，調控自身基因表達得以適應外界脅迫［20-21］。NO也是植物的一種重要信號分子，可使不兼容的病原體觸發抗性相關聯的過敏性細胞死亡，它不僅與抗病有關的信號傳導相關還能與H2O2一起協同作用誘導植物細胞的程序化死亡并參與防御反應［22-24］。通過檢測這些信號物質的產生及其動態變化，可以判斷植物抗性的激活與否以及抗性水平的高低。

本研究擬通過使用生防菌TR21和香蕉枯萎病菌1號生理小種FOC004 菌株處理感病粉蕉品種廣粉1號，研究兩者激發的與植物抗病相關的SA、NO、H2O2信號物質形成過程，以揭示枯草芽胞桿菌TR21菌株誘導粉蕉的抗性類型并為促進TR21菌株的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：枯草芽胞桿菌TR21（Bacillus subtilis strain TR21）和香蕉枯萎病菌FOC004菌株（Fusarium oxysporum f.sp.cubense Race 1，strain FOC004）由珠海市現代農業發展中心植物保護研究室分離和保藏。

供試粉蕉：品種為廣粉1號（Musa spp.ABB），粉蕉苗由廣東省農科院果樹所提供。組培苗培養至3～5片葉時，蕉苗長出較多的白嫩新根時待用。

1.2 試驗方法

試驗設清水對照、FOC004孢子懸浮液根系接種、TR21葉腋接種和TR21葉腋接種24 h后再根系接種FOC004孢子懸浮液4個處理。每個處理3次重復，每個重復3株苗，共設6個取樣時間點，為接種后0、12、24、48、72、96 h。

TR21懸液的制備：NA平板上活化兩次，挑取TR21單菌落接種于200 mL NB培養基中；37℃、180 r/min震蕩培養12 h，10%接種量轉接一次，37℃、180 r/min震蕩培養24 h；離心后無菌水稀釋，使活菌數達到 2.1×1010CFU/mL，直接使用。

FOC004懸液的制備：病原菌菌餅打于燕麥培養基上27℃培養5～6 d，待菌絲長滿整個燕麥，無菌水沖洗，4層紗布過濾；血球計數板計數，配制成濃度為1.15×107CFU/mL孢子懸浮液，備用。

接種處理方式：（1）挑戰處理（TR21+ FOC004）：提前24 h將濃度為2.1×1010CFU/mL 的TR21懸液200μL接種在蕉苗的葉腋，24 h后在果醬瓶中加入濃度為1.15×107CFU/mL的FOC004孢子懸液5 mL；（2）TR21處理：每株蕉苗葉腋滴加2.1×1010CFU/mL的TR21懸液200 μL；（3）FOC004處理：每株苗添加濃度為1.15×107CFU/mL的FOC004孢子懸液5 mL于果醬瓶中；（4）清水處理：每株蕉苗葉腋滴加200 μL無菌水，根系不接種病原菌。接種 12 h 后每個處理選取3棵苗，開始收集白色的根部組織，迅速置于-80℃保存，之后的時間點以同樣的方法收集。

菌株的培養與接種參照張陸成［25］和彭燦［26］關于TR21的培養接種方法。

1.3 SA含量測定

水楊酸測定方法及標準曲線的建立參照趙偉偉等［27］關于蓬蘽水楊酸的提取方法。按照上述條件依次測定獲得標準曲線（圖1），并得到標準曲線方程Y=0.0079X+0.773（R2=0.9981）。

水楊酸凈增加量=接菌后根系水楊酸含量-接菌前根系水楊酸含量。

圖1 SA含量測定標準曲線

1.4 H2O2和NO含量測定

根組織中H2O2測定具體方法和步驟參見上海貝博生物技術有限公司試劑盒說明書，測定參數做適當調整。H2O2測定操作表中，空白管與標準管中用50 μmol/L PBS（pH8.0）代替雙蒸水，其余不變。

根組織中NO測定具體方法和步驟參見碧云天生物技術有限公司試劑盒說明書，測定參數做適當調整。按照說明書上的條件依次測定得標準曲線（圖2）及標準曲線方程Y=0.0064X+0.0416 （R2=0.9985）?？瞻坠苤械碾p蒸水以50μmol/L PBS （pH8.0）代替，且調整為50μmol/L，標準管中的工作液與測定管中的樣品均調整為50 μmol/L。

SA、H2O2和NO的測定均選用Bio-Tek ELX800酶標儀。

用DPS7.0 軟件對試驗數據進行單因素方差分析和鄧肯氏新復極差檢驗，并使用Origin軟件制圖。

圖2 NO含量測定標準曲線

圖3 不同處理誘導的廣粉1號根系NO含量變化

2 結果與分析

2.1 NO含量測定

TR21不同處理引起廣粉1號根系NO含量發生顯著改變，挑戰處理根組織中NO的含量積累最為明顯（圖3）。處理后12 h，挑戰處理組根系中NO顯著高于清水對照、TR21噴葉和FOC004處理，其中TR21噴葉和FOC004處理顯著低于對照；24 h挑戰處理的NO含量達到最高值50.80 μg/g，顯著高于其他處理，TR21噴葉和FOC004處理的NO含量仍然顯著低于對照，TR21處理與FOC004處理之間也存在顯著差異；48 h挑戰處理的NO含量開始下降，但仍然顯著高于清水對照、TR21噴葉和FOC004處理，其中TR21處理的NO恢復到對照水平，但病原菌處理的NO仍然低于對照水平；處理后72 h，FOC004處理的根系NO水平上升，并高于其他處理，挑戰處理仍維持較高水平，但顯著低于FOC004處理，此時TR21處理的NO顯著低于其他處理；處理96 h，FOC004處理的NO水平又迅速下降，并低于對照，而TR21處理NO含量則顯著高于對照，挑戰處理的NO水平稍微回升，并高于其他處理，顯著高于FOC004處理。從不同處理NO的變化來看，TR21單獨處理及FOC004處理對NO的產生具有一定的抑制作用，而挑戰處理則可以明顯激活NO的產生，并維持較長時間的高水平。

2.2 H2O2含量測定

FOC004處理激發根系的H2O2上升比TR21葉腋接種快，但比挑戰接種慢，TR21提前接種使植物對病原菌的侵染更加敏感（圖4）。TR21處理后根組織中H2O2迅速生成，但要到48 h才達到最高峰，每克鮮根H2O2高達104.67 mg，為4個處理最高，隨后下降。而FOC004處理則在24 h達到高峰，并逐漸下降。挑戰處理的H2O2積累則更加迅速明顯，處理后12 h就顯著高于其他處理，24 h即達到最大值87.26 mg/g，72 h達到第2個峰值，呈現“M”形雙峰，這種持續的高水平有利于激發植物的抗性和殺死病原菌。

圖4 不同處理誘導的廣粉1號H2O2含量變化

2.3 SA含量測定

不同處理的廣粉1號根系總SA含量隨時間變化差異較大（圖5）。FOC004處理抑制了根系總SA含量的升高，處理后12 h和24 h，SA總含量顯著低于其他處理，直到48 h根系的總SA含量才顯著升高并維持一定的高濃度；而TR21噴葉和挑戰處理則在12 h就激發了根系SA總含量的上升，并顯著高于對照，尤其是挑戰處理，其SA含量還顯著高于TR21噴葉處理；TR21噴葉處理的SA水平早期升高并顯著高于對照，處理后48 h出現下降，但隨后又上升和下降，與H2O2的變化有一定的呼應。挑戰處理的SA水平也呈現出“M”形雙峰。

從根系不同類型水楊酸的含量變化來看，挑戰處理主要激發植物長期穩定高水平產生結合態SA，TR21處理主要激發植物早期產生游離態SA并避免產生結合態SA，而FOC004處理則抑制植物早期產生結合態和游離態SA（圖6）。

FOC004處理在應答早期抑制了結合態和游離態SA的產生，從圖6A可以看出，處理后12 h和24 h，FOC004處理的植株根系結合態SA顯著低于對照。到48 h，FOC004才激發植物產生了高水平的結合態SA，此后結合態SA持續保持較高水平并逐漸下降。與結合態SA的規律一樣（圖6B），處理后12 h和24 h，FOC004處理的植株根系游離態SA含量顯著低于對照，48 h后突然顯著升高，但到72 h又降低到與對照接近的水平，96 h后，又升高到極顯著水平。游離態SA的急劇變化反映了廣粉1號對FOC004侵染的艱難應答。

圖5 不同處理誘導的廣粉1號根系SA含量變化

圖6 不同處理誘導的廣粉1號根系結合態（A）和游離態（B）SA含量變化

TR21處理在應答的早期（12 h）只是激發了游離態SA的水平升高（圖6B），但抑制了結合態SA的水平升高（圖6A ），在隨后的時間里，降低了激發的游離態SA水平（24 h）并使之與對照水平一致（48 h后，圖6B）。處理后12 h到48 h，TR21處理的結合態SA水平一直低于對照，即使在72 h時高于對照，也和對照沒有顯著差異，并在96 h后又顯著低于對照。從SA的變化來看，TR21可能在盡量避免激發廣粉1號產生高水平的SAR反應。

與TR21和FOC004處理避免早期激發高水平SA不同，挑戰處理在早期應答（12 h）既激發了植物游離態SA的升高，又激發了植物結合態SA的升高，并以結合態的SA為主，達到了處理期間的峰值并為對照的3.1倍（圖6）。高水平的結合態SA在24 h降低到對照水平，但48 h后又迅速上升，并與FOC004誘導的高水平結合態SA保持一致。24 h后，挑戰處理對游離態SA的影響有限，游離態SA與對照沒有顯著差異。但結合態SA 在48 h后一直顯著高于對照，并在96 h顯著高于FOC004 處理。說明早期誘導的高水平結合態SA 由TR21提前處理引起，而后期的高水平結合態SA則由FOC004處理引起。TR21的提前處理使廣粉1號獲得了對FOC004提前反應的能力。

3 討論

植物在受到外界脅迫或病原菌感染后，會在體內產生大量活性氧，這種現象被稱為氧化爆發（oxidative burst），其主要形式是H2O2［28-30］。齊興柱等［31］用枯萎病菌侵染巴西蕉發現，H2O2的含量可能在 24 h達到峰值，也可能在12～36 h 的某個時刻達到峰值，這與本研究結果相一致。Li等［32］也在香蕉品種Williams-8818上證實枯萎病菌可以引起活性氧迸發，并認為H2O2與品種抗性相關。生防菌處理引起H2O2的產生也是植物早期抗病反應，H2O2對于抗病信號傳導有著重要意義［33］。本研究通過測定TR21噴葉處理對植物根系免疫信號分子H2O2的誘導效果和變化規律，從信號分子的角度確定 TR21 噴葉處理后可以激活植物的免疫反應。廣粉1號對香蕉枯萎病1號生理小種高度感病，病原菌接種能夠迅速激發H2O2升高，但TR21則先降低根系H2O2，然后再升高，呈現出試圖避免激發免疫反應的特點。挑戰接種的植物根系H2O2迅速升高，說明通過TR21的誘導，植物一旦接觸到病原菌，就能夠快速激發防御反應。顯示TR21處理不僅單獨激發了免疫反應，而且能夠使植物對病原菌入侵表現出快速反應。與H2O2的變化類似，生防菌和病原菌單獨處理的NO變化也表現出了早期抑制、后期激發的現象。FOC004接種能夠避免激發NO的早期迸發，TR21噴葉腋具有類似的效果，顯示兩種微生物的接種都在盡量避免激發NO的早期產生。而挑戰接種后，NO含量顯著上升，顯示植物經過TR21提前處理后，對病原菌的入侵反應更加靈敏。植物受到病菌或病毒侵染后會產生水楊酸一類的信號物質，這些信號物質傳導到其他部位引起水楊酸水平升高，進而誘導抗病蛋白產生，在植物全身產生抗病性［34］。水楊酸（SA）是一種小分子的酚類化合物，有游離態和結合態兩種形式，游離態的水楊酸是局部信號，結合態的水楊酸是長距離信號，它作為植物的內源激素和信號物質使植物在SAR反應方面起著重要作用，SA還介導了對香蕉抗枯萎病的信號轉導，其快速大量的提高可激活寄主的抗病反應，是香蕉抗枯萎病的關鍵所在［35-37］。TR21和挑戰處理組接種后均能在短時間內將廣粉1號的SA水平提高到一個峰值，激活植物的免疫反應以防御病原菌入侵，這可能說明枯草芽胞桿菌TR21可以促進SA的產生，挑戰處理的含量更高，積累速度更快則顯示TR21先處理，然后病原菌接種激發了SAR。同時，也顯示病原菌處理后抑制了水楊酸的產生，并消耗了本地的SA，即病原菌抑制了SAR的早期產生。從3種信號物質的變化情況來看，無論是TR21單獨處理還是挑戰處理，都能夠激發SAR，廣粉1號對FOC004的應答也涉及到了SAR途徑。如果一種抗性途徑能夠在最短的時間里被激活，則植物對病原菌的防御會增強。TR21先接種后挑戰病原菌的處理，信號物質產生的強度大、持續的時間比其他處理要久，顯示TR21的處理的確可誘導出水楊酸介導的獲得性系統抗性，挑戰后可顯著增加上述信號因子表達的水平，有利于植物防御病原菌。而病原菌則顯然抑制了防御反應的早期應答，抑制有效的防御途徑發揮作用，從而使侵染可以完成。

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（責任編輯 楊賢智）

Accumulation of resistance signal substances in Guangfen No.1 （Musa spp.ABB） roots induced by Bacillus subtilis strain TR21

ZHANG Lin1，2，CHENG Ping1，2，YU Guo-hui2，WANG Yan2，3
（1.Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China；2.Zhuhai Modern Agriculture Development Center，Zhuhai 519075，China；3.College of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

In order to reveal the relationship between systemic acquired resistance （SAR） and systemic resistance in dwarf banana Guangfen No.1 （Musa sp.ABB） that induced by Bacillus subtilis strain TR21，the signal substances，NO，H2O2and SA in the roots of Guangfen No.1 were detected.The seedlings were treated by four treatments as control （water inoculated in leaf axils），TR21 inoculated in leaf axils，Fusarium oxysporum f.sp.cubense strain FOC004 microconidia inoculated on roots and challenge inoculation （TR21 vaccinated leaf axils，24 h later FOC004 inoculated on roots），and then the SA，NO，and H2O2content in roots were detected at 6 time points after 0 h，12 h，24 h，48 h，72 h and 96 h.Results showed that，both of the TR21 and FOC004 treatments avoided activating the plant to produce NO in early stage，but challenge inoculation activated the plant roots producing NO quickly and maintaining a high levelfor long time.TR21 and FOC004 avoided activating the plant generating H2O2quickly in early stage，FOC004 only stimulated the H2O2increasing markedly in roots at 24 h，but H2O2in TR21 treated kept low level until 48 h and reached the highest level，the challenge inoculation treatment significantly stimulated the H2O2increasing at the 12 h，and remained at a high level.TR21 treatment only promoted the production of free SA，but avoided bound SA observably in the early stage，FOC004 treatment inhibited the both free and bound SA production，but challenge inoculation motivated the plant producing bound SA for a long-term and stable level.To sum up，TR21 inoculation in leaf axils early could indeed help the Guangfen No.1 response the invasion of pathogen quickly，which would help the further development and field application of TR21.

Fusarium oxysporum f.sp.cubense；Bacillus subtilis；induced resistance；signal substances

S668.1

A

1004-874X（2016）05-0101-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.05.020

2016-02-26