小麥CBL結合蛋白激酶基因TaCIPK16的克隆及特征分析

MYO THWIN，劉　芃，馬　微，薛慶賀，郭　軍，康振生

(西北農林科技大學 植物保護學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊陵 712100)

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小麥CBL結合蛋白激酶基因TaCIPK16的克隆及特征分析

MYO THWIN，劉芃，馬微，薛慶賀，郭軍，康振生*

(西北農林科技大學 植物保護學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊陵 712100)

摘要:類鈣調磷酸酶亞基B蛋白(calcineurin B-1ike protein，CBL)作為一類鈣離子結合蛋白，通過與一類蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase，ClPK)結合，從而在鈣信號依賴的生理生化過程中發揮作用。該研究在條銹菌誘導的小麥葉片中克隆獲得CIPK家族中1個基因TaCIPK16，并利用qRT-PCR技術、酵母雙雜交技術及亞細胞定位技術分析了其功能特性。序列分析表明，TaCIPK16編碼447個氨基酸，包含保守的激酶催化結構域及調控結構域，與水稻、擬南芥CIPK蛋白具有高度相似性。酵母雙雜交分析驗證顯示，TaCIPK16與TaCBL4和TaCBL9存在強烈互作。定量分析表明，TaCIPK16受到條銹菌的誘導表達，在小麥與條銹菌互作過程中呈顯著差異表達趨勢。綜上結果，TaCIPK16可能作為正調控因子參與了小麥對條銹菌的抗病防衛反應。

關鍵詞:小麥，CBL，蛋白激酶，TaCIPK16，條銹菌

在適應復雜多變自然環境的進化中，植物形成了完善的信號通路。Ca2+是信號傳導中重要的第二信使，在植物的生理和生長過程中起著重要的作用。植物在響應外界的信號和脅迫時，細胞中的Ca2+水平會發生相應的改變[1]。植物中存在3種鈣離子結合蛋白，分別是鈣調素CaM (Calmodulin)及其相關蛋白、鈣依賴性蛋白激酶(Ca2+-dependent protein kinases, CDPK)、鈣調磷酸酶B類蛋白(calcineurin B-like protein, CBL)[2]。其中CBL本身沒有激酶活性，必須和靶蛋白CIPK結合形成復合體才能發揮作用[3]。CIPK是一個植物特有的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族，屬于第3類的SnRK3 激酶(SNF1-related protein kinase3, SnRK3)[4]。對模式植物擬南芥CIPK蛋白的結構分析表明，所有的CIPK蛋白含有N-端的激酶蛋白域和C-端的調節域，后者為CBL特異接合的NAF結構域[5]和能與PP2C相互作用的PPI結構域[6]。

前期研究表明CIPK家族基因參與響應高鹽、滲透或者干旱脅迫，冷脅迫，以及低K+、硝酸鹽、低氧等其它脅迫[7]。在擬南芥中，AtCIPK23 可以與 AtCBL1互作，磷酸激活 K+通道 (AKT1)促進 K+的吸收[8]。當擬南芥遭受高鹽脅迫時, SOS3(CBL4)及CBL10結合Ca2+, 隨后與SOS2(CIPK24)蛋白激酶結合形成蛋白復合體, 分別在地下及地上部分調控相應靶蛋白的表達, 從而使植物能抵御或減輕高鹽脅迫帶來的傷害[9]。在水稻中，通過RNAi技術沉默OsCIPK23能夠導致水稻抗旱性的減弱[10]。除此之外，CBL-CIPK信號系統廣泛參與植物生理和發育的過程。水稻中OsCIPK15與水稻的缺氧耐性有關，可能調節SnRK1A整合缺氧響應和糖信號反應[11]。在CIPK6功能缺失的突變體cipk6中，向基式與向頂式的生長素運輸均明顯減弱，造成植株表現為子葉融合、下胚軸膨大、側根發生延遲等生長缺陷[12]。

除此之外，關于CIPK蛋白激酶在植物響應生物脅迫過程中的作用也有了一定的研究。眾所周知，活性氧(reactive oxygen species, ROS)在植物抗病反應中起到至關重要的作用，它能夠引起細胞壞死，從而限制病原菌的進一步擴展，并且可作為一個信號分子誘導抗病相關基因的表達[13]。在擬南芥中，AtCIPK26能夠和一個NADPH氧化酶AtRbohF互作并負調控其產生ROS[14]。在水稻中，OsCIPK14/15能都受到病原相關分子模式(microbe-associated molecular patterns，MAMP)的誘導，若OsCIPK14/15的表達受到抑制，MAMP誘導產生的ROS也受到抑制，從而說明OsCIPK14/15參與了PAMP誘導的抗性(PAMP-triggered immunity, PTI)[15]。在番茄中，CBL10和CIPK6能夠正調控細胞免疫反應和細胞程序性死亡。在煙草中，CIPK6與CBL10的互作參與ETI(effector-triggered immunity)過程中ROS的產生[16]。有研究表明，水楊酸信號通路也受到了CIPK的調節。在擬南芥中，NPR1能夠被CIPK11/PKS5磷酸化，從而誘導WKY38和WKY62的表達[17]。

目前，小麥中關于CIPK蛋白激酶在生物脅迫中的功能知之甚少。研究小麥CIPK蛋白激酶在小麥-條銹菌互作體系的功能對闡釋其作用機理具有重要的意義。因此，本研究分離獲得了一個蛋白激酶基因TaCIPK16，并利用qRT-PCR技術、酵母雙雜交技術及亞細胞定位技術分析了其功能特性，為進一步揭示其在小麥-條銹菌互作過程中的分子機理奠定了基礎。

1材料與方法

1.1供試材料及試驗試劑

本實驗所用小麥條銹菌生理小種為‘條中23號’(CYR23)和‘條中31號’(CYR31)，小麥品種為‘銘賢169’和‘水源11’。小麥培養、條銹菌繁殖及接種方法參考Kang等[18]的方法。Taq DNA 聚合酶(Fermentas，美國)，dNTP、pMD18-T(Takara，日本)，瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒(百泰克，中國)，Top10感受態細胞(Wolsen，美國)，質粒提取盒(BioMiga，美國)，限制性內切酶(Fermentas，美國)，T4 DNA連接酶(Fermentas)，BIOZOL(BioFlux,日本)，RNase inhibitor(Promega，美國)，M-MLV反轉錄試劑盒(Fermentas，美國)，SY BR Green 和 Rox reference 染料(Invitrogen,美國)。

1.2方法

1.2.1TaCIPK16基因的克隆在TAIR v10 (http://www.arabidopsis.org/)和RGAP v7 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)數據庫中得到擬南芥和水稻的CIPK序列，在中國春基因組數據庫中(http://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Genes-annotations)得到小麥cDNA數據庫，并以水稻和擬南芥的CIPK序列為種子序列，參照NCBI“BLAST+ user manual”中的方法，對下載的小麥cDNA數據庫進行本地BLAST檢索，得到小麥候選的CIPK序列，并通過MEGA5.0構建進化樹明確與OsCIPK16親緣關系最近的序列，即為候選的TaCIPK16。根據序列分析得到的候選基因序列設計引物TaCIPK16-F/R(表 1)。提取水源11葉片總 RNA 并反轉錄成 cDNA，具體方法參照 Ferments ReverAid First Strand cDNA synthesis 試劑盒操作說明。以 cDNA 為模板，PCR 擴增程序為95 ℃預變性 5 min，95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共 35 個循環；72 ℃ 延伸10 min。PCR 產物純化后連接到pGEM?-T Easy載體，經大腸桿菌轉化后提取質粒并送測序。

1.2.2序列分析將實驗克隆測序的結果和通過預測得到的候選基因序列進行相似性比對。使用ExPAsy網站的在線軟件Compute pI/Mw tool(http://web.expasy.org/compute_pi/)進行計算編碼蛋白的等電點和分子量；利用DNASTAR軟件，BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)和ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進行cDNA序列的分析。利用ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) 和 DNAMAN7.0 軟件(version 7.0; Lynnon Biosoft, USA)進行序列比對分析。使用 MEGA5 software (version 5.0)軟件以鄰接法(Neighbor-Joining method)進行目的蛋白與其同源蛋白的多重序列比對及進化樹分析。使用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/) 和 PROSITE Scan (http://prosite.expasy.org/scanprosite/) 來預測蛋白的保守蛋白結構域。

1.2.3酵母雙雜交分析設計并合成TaCBL4(GenBank登錄號為KU736850)和TaCBL9(GenBank登錄號為KU736852)酵母雙雜交克隆引物TaCBL4-BD-F/R、TaCBL9-BD-F/R(表 1)，并克隆至pGBKT7載體上，設計TaCIPK16酵母雙雜交克隆引物TaCIPK16-AD-F/R(表 1)，并克隆至pGADT7載體上。按照酵母雙雜交手冊(Clontech, Japan)，將TaCBL4與TaCIPK16或者TaCBL9與TaCIPK16共轉至酵母菌株AH109中，并分別在缺陷性培養基SD-Leucine-Tryptophan (-L-T)和SD-Ade-nine-Histidine-Leucine-Tryptophan(含20 μg·mL-1的X-α-Gal)(-L-T-H-A+ X-α-gal)上進行培養。培養4 d后，利用血球計數板將酵母細胞稀釋到每毫升水含有107、106、105和104個細胞，點至-L-T-H-A+ X-α-gal培養基上培養，24 h后照相。

表1　引物表

1.2.4亞細胞定位依據pCaMV35S:GFP中多克隆位點信息，設計并合成TaCIPK16亞細胞定位克隆引物TaCIPK16-163-F/R(表1)，并將TaCIPK16克隆至pCaMV35S:GFP中，參照Li 等[19]的方法，制備小麥原生質體，并參照該方法將融合載體pCaMV35S:TaCIPK16∶GFP及空載體pCaMV35S∶GFP轉至小麥原生質體中，培養18 h后，通過共聚焦顯微鏡進行觀察并照相。

1.2.5qRT-PCR分析根據克隆出來的TaCIPK16 基因和內參基因小麥延伸因子TaEF-1α(GenBank登錄號Q03033)分別設計特異定量引物TaCIPK16-qRT-F1/R1及TaEF1-F/R(表 1)。采集接種條銹菌后 0、12、18、24、72和120 h 時間點的葉片提取 RNA，反轉錄為 cDNA，以此 cDNA為模板，qRT-PCR 反應程序為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性，10 s，55 ℃ 退火 20 s，72 ℃延伸 40 s，共40個循環。qRT-PCR的反應體系及程序參照Feng等的方法[20]，最后采用2-ΔΔCt法計算目標基因對內參基因的相對表達量。

2結果與分析

2.1小麥TaCIPK16基因的克隆及序列分析

通過RT-PCR技術克隆得到的cDNA序列具有1 606個核苷酸(圖1)，編碼1個447氨基酸的蛋白，蛋白分子量為 49.521 kD ，等電點為9.09。使用InterProScan軟件分析表明，其N端包含一個蛋白激酶結構域，C端含有一個調控結構域， 在調節域中包含能夠與CBL 特異結合的NAF結構域及與PP2C相互作用的PPI結構域(圖 2)。利用擬南芥與水稻中所有的CIPK序列氨基酸序構建進化樹發現該蛋白與水稻的OsCIPK16(LOC_Os09g25090)及擬南芥中的AtCIPK5(AAF86504)、AtCIPK16(AAK50348)及AtCIPK25(AF44226)同屬一個分支(圖 3)。5條序列比對分析表明，該蛋白序列與OsCIPK16相似度達到88.04%，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)中AtCIPK16相似度達到76.43%，故命名為TaCIPK16。

1～2. PCR擴增產物；M. Marker圖1　TaCIPK16基因cDNA的PCR擴增片段1-2. PCR product; M. MarkerFig. 1　Electrophoresis of TaCIPK16 cDNA fragment

At. 擬南芥CIPK序列；Os. 水稻CIPK序列；箭頭指出本實驗克隆的TaCIPK16序列；節點上的數值表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復該節點的可信度圖3　TaCIPK16與水稻、擬南芥中CIPK家族的進化樹分析At, CIPK sequences of Arabidopsis download from TAIR v10; Os, CIPK sequences of rice download from RGAP v7; The arrow indicates TaCIPK16; The numbers at the nodes represents the reliability based on 1 000 replicatesFig. 3　Phylogenetic analysis of TaCIPK16 with CIPK family from rice and Arabidopsis

虛線表示N端蛋白激酶結構域；黑線表示C端調控結構域；黑框表示NAF結構域；虛線框表示PPI結構域圖2　TaCIPK16與水稻、擬南芥同源基因的多序列比對The conserved protein kinase domain and regulatory domain are marked with black full line and dash line, respectively. The conserved NAF and PPI motifs are marked with black box and dash boxFig. 2　Multi-sequence alignment of TaCIPK16 with homologous proteins in rice and Arabidopsis

2.2酵母雙雜分析

為了驗證 TaCIPK16和TaCBL4或TaCBL9是否有相互作用，將TaCIPK16與TaCBL4或者TaCIPK16與TaCBL9共同轉至酵母中。在篩選培養基SD-Leucine-Tryptophan上酵母能夠正常生長，說明2種融合質粒成功轉入酵母中(圖 4，A)。在篩選培養基SD-Adenine-Histidine-Leucine-Tryptophan(含20μg·mL-1X-α-Gal)酵母能夠生長并且成藍色，與陽性對照相似，說明TaCIPK16與TaCBL4和TaCBL9均存在互作(圖 4，B)。將酵母培養液稀釋到每毫升含有104個酵母細胞時，仍能觀察到酵母的生長，表明TaCIPK16與TaCBL4和TaCBL9具有強烈的互作。

含有重組質粒的AH109酵母菌株在選擇培養基SD-Leucine-Tryptophan (-L-T)和SD-Adenine-Histidine-Leucine-Tryptophan(加20 μg/mL的X-α-gal)培養；A、B.陽性對照，Takala酵母試劑盒中的SV40 large T-antigen和murine p53互作結果：C、D.TaCIPK16和TaCBL4的互作結果；E、F.TaCIPK16和TaCBL9的互作結果；G、H.陰性對照，Takala酵母試劑盒中SV40 large T-antigen 與human lamin的互作結果圖4　TaCIPK16與TaCBL4、TaCBL9的互作分析Cells of yeast strain AH109 harboring the indicated plasmid combinations were grown on selective media SD-Leucine-Tryptophan (-L-T) and SD-Adenine-Histidine-Leucine-Tryptophan (containing 20 μg/mL X-α-gal); A, B. Positive control, the interaction between SV40 large T-antigen and murine p53；C, D. The interaction of TaCIPK16 and TaCBL4: E，F. The interaction between TaCIPK16 and TaCBL9; G，H. Negative control, the interaction between SV40 large T-antigen and human lamin C.Fig. 4　Analysis of interactions between TaCIPK16 and TaCBL4/TaCBL9

A～D.陽性對照，pCaMV35S:GFP轉化的小麥原生質細胞；E～H.pCaMV35S:TaCIPK16:GFP轉化的小麥原生質細胞；A、E.受激發的GFP熒光和葉綠體自發熒光組合結果；B、F.葉綠體自發熒光；C、G.受激發的GFP熒光；D、H.白光下的原生質細胞圖5　小麥原生質體中TaCIPK16亞細胞定位分析(Bar= 5 μm)A～D. Positive control, pCaMV35S:GFP; E～H. pCaMV35S:TaCIPK16:GFP; A, E. overlay; B, F. Chloroplast; C, G. GFP; D, H. Bright field.Fig. 5　Subcellular localization of TaCIPK16 in wheat protoplasts

圖6　TaCIPK16基因在小麥-條銹菌互作過程中的轉錄表達特征Fig. 6　Expression pattern of TaCIPK16 during the compatible and incompatible interaction between wheat and Pst

2.3亞細胞定位分析

為驗證TaCIPK16在小麥細胞中的分布情況，將融合載體pCaMV35S∶TaCIPK16∶GFP以及空載體pCaMV35S∶GFP轉移至小麥原生質體中。結果表明，TaCIPK16在小麥細胞中分布與陽性對照GFP的情況相同，在整個小麥細胞中均有分布(圖 5)。

2.4小麥TaCIPK16基因的實時定量RT-PCR分析

實時定量RT-PCR分析結果表明，TaCIPK16受到條銹菌誘導表達。在非親和互作(CYR23)中，TaCIPK16轉錄水平在接種后6～36 h低于0 h表達水平，呈下調表達；當到48 h表達量明顯上調，并達到峰值(相對表達量為10.8)，在以后的時間點，表達量恢復到初始水平(圖 6)。在親和互作(CYR31)中，TaCIPK16的相對表達趨勢與在非親和中的表達趨勢相同，但在接菌48 h后輕微的上調表達量(相對表達量為2)顯著低于在非親和互作中表達量(圖 6)。由此推斷，TaCIPK16可能參與了小麥對條銹菌的抗病防衛反應。

3討論

在已有的研究中，植物CIPK基因家族是一個較大的家族，家族內不同的CIPK成員的功能存在特異性，可以響應一種或者多種生物或非生物脅迫。本研究克隆了1個小麥中編碼CIPK蛋白激酶的基因，其與擬南芥和水稻中的AtCIPK16和OsCIPK16具有高度的相似性，尤其是N-端的催化結構域和C端的調節結構域，推測TaCIPK16能夠感知Ca2+信號，并且功能與水稻和擬南芥中的CIPK16蛋白功能高度保守。

CBL蛋白需要與CIPK蛋白激酶結合形成蛋白復合體，能激活細胞內一系列的生理生化的變化。以前研究表明，不同的CBL蛋白與不同的CIPK蛋白結合能夠產生不同的信號通路，并且在不同的信號通路之間，CBL-CIPK蛋白復合體也起到橋梁的作用[21]。因此，明確CIPK與CBL的互作網絡是研究CIPK蛋白作用機理的基礎。本研究中通過酵母雙雜技術，明確TaCIPK16與TaCBL4和TaCBL9有強烈的互作關系。由此推斷，TaCIPK16能夠響應多種環境對植物的刺激，并且能與小麥CBL形成不同蛋白復合體發揮其特異功能。

分析CIPK在細胞中的分布情況有助于理解CBL-CIPK蛋白復合體的功能及其特異的鈣離子信號通路。在擬南芥中CIPK家族中的大部分基因都分布在細胞核與細胞質中[22]。在玉米中，ZmCIPK16主要定位在細胞核和細胞膜上，在細胞質中含量相對較少[2]。在本實驗中，TaCIPK16也分布于整個細胞中，推斷TaCIPK16與ZmCIPK16功能具有保守性。同時，細胞中蛋白的定位情況和其功能關系密切相關，因此推測在細胞中TaCBL4-TaCIPK16與TaCBL9-TaCIPK16蛋白復合體能夠激活多種蛋白所引起的信號通路。

TaCIPK16基因在條銹菌誘導下呈上調表達趨勢，說明其參與了條銹菌誘導的小麥抗病防衛反應，但親和反應和非親和反應中的表達量差異說明TaCIPK16很可能參與了小麥R基因介導的抗病信號通路，在小麥-條銹菌組成的非親和互作過程中起重要作用。根據Wang等[23]報道，在非親和互作反應中，接種條銹菌前期12～24 h，是小麥細胞活性氧爆發階段并在24 h時達到峰值，而接菌24 h之后活性氧的含量才開始降低，到接菌后48 h，活性氧的含量達到最低。而本實驗中在接菌后12～36 hTaCIPK16的表達水平受到抑制，而在接菌后48 h TaCIPK16受到誘導且表達水平到最大。有研究表明，小麥TaCIPK29參與調控ROS信號通路[24]。因此推測TaCIPK16可能在小麥-條銹菌非親和互作過程中調控ROS信號通路以此介導小麥的抗病防衛反應。

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(編輯:宋亞珍)

文章編號:1000-4025(2016)06-1073-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1073

收稿日期:2016-04-27;修改稿收到日期:2016-05-23

基金項目:國家“973”計劃(2013CB127700)；國家自然科學基金(31371889)；教育部新世紀優秀人才支持計劃(NCET-12-0471)；高等學校學科創新引智計劃(B07049)

作者簡介:MYO THWIN(1990-)，男，碩士，主要從事植物免疫學研究。E-mail: myothwinpatho@gmail.com *通信作者:康振生，教授，博士生導師，主要從事小麥條銹病的防控研究。E-mail: kangzs@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號:Q785;Q786

文獻標志碼:A

Characterization of a CBL-interacting Protein Kinase GeneTaCIPK16 in Wheat

MYO THWIN, LIU Peng, MA Wei, XUE Qinghe, GUO Jun, KANG Zhensheng*

(State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, College of Plant Protection, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, China)

Abstract:The calcineurin B-like (CBL)-CBL-interacting protein kinase (CIPK) network plays a pivotal role in regulating the physiological as well as developmental processes in plants. In this study, we obtained a CIPK gene, TaCIPK16, from the wheat leaves infected by Puccinia striiformis f. sp. tritici (Pst) using in silico cloning and RT-PCR. The full-length cDNA of TaCIPK16 was 1 606 bp, which encoding 433 amino acids. Multi-sequence alignment showed that TaCIPK16 share high similarity with OsCIPK16 and AtCIPK16 in rice and Arabidopsis, respectively. Analysis of the protein domain features indicated that TaCIPK16 contained conserved regulatory domain in C-terminal and protein kinases domain in N-terminal. Subcellular localization assays revealed that TaCIPK16 displayed a localization pattern similar to that of the GFP control, indicating a cytoplasmic and nuclear localization. Yeast two-hybrid assays showed that TaCIPK16 strongly interacts with TaCBL4 and TaCBL9, respectively. qRT-PCR assays indicated that TaCIPK16 was induced by Pst infection and differentially expressed during incompatible and compatible interactions between wheat and Pst. Our results suggest that TaCIPK16 has a positive role in regulating wheat resistance against Pst.

Key words:wheat; CBL; protein kinase; TaCIPK16; Puccinia striiformis f. sp. tritici