松墨天牛轉鐵蛋白基因克隆及生物信息學分析

蔡紫玲，劉琪司，林 同

（華南農業大學林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642）

松墨天牛轉鐵蛋白基因克隆及生物信息學分析

蔡紫玲，劉琪司，林 同

（華南農業大學林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642）

轉鐵蛋白是一類非血紅素結合鐵的β1-球蛋白，廣泛分布于脊椎動物和無脊椎動物體內。克隆了松墨天牛轉鐵蛋白基因（登錄號：KU213914），命名為MaTf，其核苷酸序列全長為2 549 bp，包含一個2 178 bp的開放閱讀框（ORF）和一個371 bp的帶有加尾信號的3'非編碼區（3'UTR）。采用生物信息學方法分析MaTf的編碼蛋白，結果顯示：松墨天牛轉鐵蛋白分子量約為80 ku，等電點為7.36，為穩定蛋白，有信號肽，不含跨膜結構域，有1個糖基化位點，有平均分布在整條肽鏈的43個磷酸化位點。二級結構多為隨機卷曲，僅有21.52%α螺旋，24%β片層（延伸鏈）結構，能形成三段卷曲螺旋，為親水性蛋白，N端和C端各有1個TR_FER結構域。

松墨天牛；轉鐵蛋白；生物信息學；結構域

蔡紫玲，劉琪司，林同.松墨天牛轉鐵蛋白基因克隆及生物信息學分析［J］.廣東農業科學，2016，43（4）：117-123.

松墨天牛（Monochamus alternatus）是毀滅性病害松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）的主要媒介昆蟲，也是松樹的重要蛀干害蟲。松墨天牛的寄主植物多為松屬（Pinus）植物，包括黑松（Pinus thunbergii）、馬尾松（Pinus massoniana）、云南松（Pinus yunnanensis）、赤松（Pinus densiflora）等［1］，也可危害冷杉屬（Abies）、黃杉屬（Pseudotsuga）、落葉松屬（Larix）、鐵杉屬（Tsuga）和雪松屬（Cedrus）等［2］。另外，松墨天牛分布廣泛，已成為國內南方松林最具危險性的天牛［3］。

轉鐵蛋白（Transferrin），又稱為運鐵蛋白、鐵傳遞蛋白、嗜鐵蛋白、鐵糖蛋白，是一類非血紅素結合鐵的β1-球蛋白，廣泛分布于脊椎動物和無脊椎動物體內［4］。轉鐵蛋白為單鏈糖基化蛋白，相對分子質量約為70～80 ku，等電點一般呈酸性，糖基約占6%，在N端和C端各有一個高同源性的球形結構域，每個結構域含有1個可逆性結合Fe3+離子位點和1個陰離子結合位點［5］。由于轉鐵蛋白具有螯合鐵離子的能力，因此轉鐵蛋白主要負責輸送鐵離子到紅細胞作為合成血紅蛋白使用，或者運輸到機體內其他需鐵的部位［6］。另外，鐵離子是細菌生長的必要因子，因此轉鐵蛋白也能夠抗菌殺菌，有自我保護的抗病作用［7］。

在昆蟲綱中，有關轉鐵蛋白的研究報道有鱗翅目的云杉卷葉蛾（Choristoneura fumiferana）［8］、小菜蛾（Plutella xylostella）［9］、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）［10］、水稻二化螟（Chilo suppressalis Walker）［11］，雙翅目的白紋伊蚊（Aedes albopictus）［12］、淡色庫蚊（Culex pipiens pallens）［13］、埃及伊蚊（Aedes aegypti）［14-15］、刺舌蠅 （Glossina morsitans）［16］，膜翅目的蜜蜂（Apis mellifera）［17］、紅火蟻［18］（Solenopsis invicta Buren）。但尚未有相關鞘翅目昆蟲轉鐵蛋白的報道。本研究成功克隆了松墨天牛轉鐵蛋白基因cDNA序列全長，并分析其核苷酸序列基本特征及其推導氨基酸序列的理化特性、信號肽、疏水性、跨膜結構、二級結構、結構功能等，為研究昆蟲轉鐵蛋白分子特征提供依據，也為深進一步研究昆蟲轉鐵蛋白與抗藥性機制提供了分子依據。

1 　材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試天牛 松墨天牛在廣州市從化區馬尾松次生林誘捕所得，將整只成蟲經液氮迅速冷凍后，置于-80℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑 E.Z.N.A.TMTotal RNA Kit II總RNA試劑盒購于OMEGA公司；3'-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒、pMD20-T Vector、E.coli DH5 α Competent Cells購自TaKaRa公司；通用型DNA純化回收試劑盒為天根生物有限公司產品；LB培養基配置試劑（Yeeast Extract、Tryptone Powder、NaCl）、IPTG及X-Gal等為上海生工生物工程有限公司產品。

1.2 松墨天牛轉鐵蛋白基因cDNA的克隆

1.2.1 總RNA提取 取約20 mg松墨天牛成蟲樣本，加液氮研磨成粉末狀，根據RNA抽提試劑盒（OMEGA公司）說明書進行總RNA提取操作。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，經微量紫外分光光度儀（Nanodrop 2000）檢測RNA濃度后，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 引物設計 從實驗室構建的松墨天牛cDNA文庫中篩選含有完整5'端的轉鐵蛋白基因序列，采用引物設計軟件Primer premier 5.0，根據引物設計原則設計3'RACE引物：Outer：5'- GTCACACAGGAATAGGGCG-3'，Inner：5'-GGAAGAGCAAAGGCGGACG-3'。

1.2.3 松墨天牛轉鐵蛋白3'RACE擴增 以總RNA反轉錄的cDNA為模板，以特異性引物Outer 和Inner為引物進行巢式PCR，Outer PCR反應體系：3'RACE Outer Primer（10 μmol/L） 2 μL，10 ×LA PCR Buffer II（Mg2+Free）4 μL，MgCl2（25 mmol/L） 3 μL，cDNA 3 μL，1×cDNA Dilution Buffer II 7 μL，Gene Specific Outer Prier（10 μmol/L） 2 μL，TaKaRaLA Taq? （5 U/μL） 0.25 μL，加水至50 μL。PCR程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，20個循環；72℃ 10 min。

Inner PCR反應體系：dNTP Mixture （2.5 mmol/L each） 8 μL，10×LA PCR Buffer II （Mg2+Free）5 μL，MgCl2（25 mmol/L） 5 μL，TaKaRaLA Taq? （5 U/μL） 0.5 μL，3'RACE Inner Primer（10 μmol/L） 2 μL，1st PCR產物 1 μL，Gene Specific Inner Primer（10 μmol/L） 2 μL，加水至50 μL。PCR反應程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，30個循環；72℃ 10 min。

1.2.4 DNA純化及T-載體連接 3'RACE產物經瓊脂糖凝膠電泳后，切下含目的片段的電泳條帶，按通用型DNA純化回收試劑盒說明書進行Inner PCR產物回收。取純化的Inner PCR產物4 μL，1 μL pMD20-T Vetor，DNA Ligation Mix 5 μL，加dH2O至10 μL進行T-載體連接，放在4℃冰箱24 h。

1.2.5 重組質粒轉化及序列測定 取T-載體連接產物4 μL轉化到50 μL感受態大腸桿菌DH5α中，涂布于含有氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB培養基平板，37℃培養12 h。提取白色菌落的單克隆體進行菌落PCR鑒定，再挑取4個陽性克隆送上海生物工程有限公司測序。

1.3 序列分析

1.3.1 松墨天牛轉鐵蛋白基因編碼蛋白的理化性質分析 測定序列拼接完成后，經NCBI的BLASTp程序鑒定為一種松墨天牛轉運蛋白基因的序列，將序列提交到GenBank數據庫（序列號：KU213914）。通過NCBI數據庫的BLASTp程序、ORF Finder（Open Reading Frame Finder）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）以及ProtParm（http：//web.expasy.org/protparam/）對序列進行在線分析，確定轉鐵蛋白基因序列的編碼區并預測其編碼蛋白質的理化性質，進行穩定性和半衰期的評估；信號肽預測采用SignalP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）在線分析；跨膜結構域分析利用在線工具TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；糖基化位點采用DictyOGlyc 1.1 Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/）預測；磷酸化位點采用NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測；疏水性采用Expasy提供的在線工具ProtScale程序（http：//web.expasy.org/protscale/）分析。

1.3.2 松墨天牛轉鐵蛋白基因編碼蛋白的結構及功能分析 利用GOR在線工具（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）完成蛋白質的二級結構預測，并通過COILS Server（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）分析其卷曲螺旋結構；利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）在線進行同源建模；利用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）對其結構域進行預測。

1.3.3 基于昆蟲轉鐵蛋白基因推導的氨基酸序列分析 采用軟件DNAMAN對松墨天牛與其他12種昆蟲轉鐵蛋白氨基酸序列進行同源性比對，而系統發育樹則通過Clustalx和MEGA4軟件（NJ法）構建。

2 結果與分析

2.1 松墨天牛轉鐵蛋白核苷酸序列組成

以松墨天牛cDNA為模板，采用3'RACE克隆得到轉鐵蛋白cDNA序列，其核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列已提交GenBank（登錄號：KU213914），命名為MaTf。MaTf的全長cDNA序列有2 549 bp，包含一個2 178 bp的開放閱讀框（ORF）和一個371 bp的帶有加尾信號的3'非編碼區（3'UTR）。

2.2 MaTf理化性質

MaTf共有725個氨基酸，計算分子量約為80 ku，分子式為C3561H5611N967O1080S33，等電點為7.36，預測MaTf是一類穩定蛋白，這些為MaTf蛋白質的分離和純化提供了依據。

2.3 昆蟲轉運蛋白氨基酸序列比對

經過 B L A S T p分析松墨天牛的轉鐵蛋白，搜索并篩選了 1 2種昆蟲的轉鐵蛋白，分別為Apriona germari（AAW70172.1）、Tribolium castaneum（XP_001808066.1）、Protaetia brevitarsis（ABI31834.1）、Zootermopsis nevadensis（KDR19744.1）、Mastotermes darwiniensis（AAN03488.1）、Romalea microptera （AAQ62963.2）、Nephotettix cincticeps （BAQ94504.1） 、Papilio xuthus （KPI94090.1）、Apis dorsata （XP_006608191.1）、Aedes aegypti （XP_001647578.1）、Drosophila melanogaster （AAC67389.1）、Glossina morsitans morsitans （AAM46784.3）。使用DNAMAN軟件對氨基酸序列進行同源性比對，發現松墨天牛與桑天牛（Apriona germari）的同源性最高，氨基酸一致性在90%以上；與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、白星花金龜（Protaetia brevitarsis）的同源性較高，氨基酸一致性在70%以上，與其余昆蟲的同源性較低，氨基酸一致性在43%～59%之間（圖1）。

2.4 基于昆蟲轉運蛋白的系統發育樹

采用Clustalx和MEGA4對松墨天牛和7個目12種昆蟲的轉鐵蛋白氨基酸序列建立系統進化樹（圖2），結果顯示，桑天牛、赤擬谷盜、白星花金龜同屬于鞘翅目，與松墨天牛的親緣關系較為接近，云南野生大蜜蜂、柑桔鳳蝶等與松墨天牛的親緣關系最遠。

2.5 信號肽、跨膜結構域及翻譯后修飾分析

信號肽位于初生蛋白的N端，一般由15～30個氨基酸殘基組成，是一段能引導新合成肽鏈轉移到內質網上的多肽［19］。經過Singal IP 4.1在線分析，以0.5分為閾值，C分值0.715在20位點，Y分值0.780在20位點，S分值0.956在1位點，信號肽計算結果為“Yes”，即表示松墨天牛轉鐵蛋白N端有信號肽，為分泌蛋白。

TMHMM采用馬氏模型，綜合跨膜區螺旋長度、親疏水性和膜蛋白拓撲學等特性，能有效地預測肽鏈的跨膜區及膜內外區。根據TMHMM Server分析，結果顯示松墨天牛轉鐵蛋白不含跨膜結構域，且整條肽鏈都位于膜外。

采用DictyOGlyc在線軟件對MaTf氨基酸序列的糖基化位點進行分析，發現MaTf含有1個糖基化位點，位于196位，為絲氨酸。

圖1 松墨天牛與12種昆蟲的轉運蛋白氨基酸序列的同源比對

NetPhos2.0 Server磷酸化位點分析MaTf，結果發現磷酸化位點在整條肽鏈上的分布較平均，計算分值＞0.5的有：絲氨酸（Ser）磷酸化位點20個，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點8個，酪氨酸（Tyr）磷酸化位點15個。

2.6 二級結構、卷曲螺旋及疏水性分析

GOR在線預測松墨天牛轉鐵蛋白的二級結構，結果（圖3）表明，α螺旋占21.52%，β片層（延伸鏈）結構占24%，隨機卷曲最多，占 54.48%，并不存在β轉角等其他結構。根據COILS Server分析，MaTf有3段序列可形成卷曲螺旋。MaTf疏水性最大分值為3.456、在第8位點，而最小分值為-2.811、在第27位點，為親水蛋白。

圖2 基于松墨天牛與12種昆蟲轉運蛋白構建的系統發育樹

圖3 MaTf二級結構GOR分析

2.7 同源建模與功能結構域分析

提交MaTf氨基酸序列到SWISS-MODEL在線軟件進行分析，結果顯示該蛋白的三維結構分子（圖4）有明顯的兩個分區折疊。

根據SMART在線工具分析，MaTf存在兩個功能結構域，為TR_FER（圖5）。第1個功能結構域位于32～378個氨基酸殘基，第2個機構域位于379～725個氨基酸殘基。

圖4 MaTf的同源建模SWISS-MODEL分析

圖5 MaTf的結構功能域SMART分析

3 討論

作為脊椎動物和無脊椎動物體內轉運鐵離子的主要蛋白，轉運蛋白在成紅細胞合成血紅蛋白過程中起重要作用，表現在其結構上的保守性。本試驗克隆了松墨天牛轉鐵蛋白（MaTf）基因cDNA的全長序列，其推導的氨基酸序列長達725個氨基酸殘基。通過生物信息學分析，MaTf含有信號肽，不含跨膜結構域，二級結構大部分為隨機卷曲，21.52%為α螺旋，24%為β片層（延伸鏈）結構，在300～600之間能形成兩段卷曲螺旋。根據SMART對MaTf的功能結構域分析，MaTf有兩個TR_FER功能結構域，經過比對其他昆蟲序列，發現除了雙翅目昆蟲有且僅有1個TR_FER結構域外［20］，其他鞘翅目、等翅目、直翅目、半翅目、膜翅目的昆蟲均有兩個TR_FER。通過比對人轉鐵蛋白序列，得知人轉鐵蛋白也含有兩個TR_FER結構域。轉鐵蛋白這兩個功能類似的結構域有一定的同源性，都保留了結合鐵原子和碳酸陰離子的氨基酸位點，被認為是機體進化過程中以基因復制方式形成的，可加強對鐵離子的轉運能力［21-22］。由于鞘翅目昆蟲比雙翅目昆蟲更為進化，前者比后者在C端多1個TR_FER結構域，可能發揮更豐富的生理功能。

由于轉鐵蛋白具有抗菌殺菌的功能，對大腸埃希菌生長有明顯抑制作用，因此在昆蟲中可作為新的抗性檢測的基因靶標［13］。2011年王霄等［12］驗證了轉鐵蛋白基因在白紋伊蚊溴氰菊酯抗性品系高表達，推測該基因可能與蚊蟲抗性機制相關。人轉鐵蛋白N端半分子能在體外表達并具有活性，因此在醫學界被作為藥物運輸載體應用于臨床階段［23］。目前未見有關于昆蟲轉鐵蛋白基因外源表達的研究報道，將來可利用該基因進行昆蟲抗性監測。

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（責任編輯 崔建勛）

Cloning and bioinformatics analysis of transferring gene of Monochamus alternatus

CAI Zi-ling，LIU Qi-si，LIN Tong
（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Abstracts：Transferrin，a non-heme iron beta1 globulin，is widely distributed in vertebrate and invertebrate animals.The gene of transferrin of Monochamus alternatus （GenBank accession number is KU213914） was cloned and named as MaTf in this study.The whole length of MaTf was 2 549 bp，including 2 178 bp open reading frame （ORF） and 371 bp non-encoding region with a tail signal.Bioinformatics methods were used to analyze the characteristics of MaTf.The results showed that MaTf was a stable protein with molecular weight of 80 ku and isoelectric point of 7.36.There was a signal peptide，one glycosylation site，and 43 phoshorylaton sites in MaTf.The transmembrane domain structure was not found.Random curls，alpha helix （21.52%） and beta extension structure （24%） existed in the secondary structure，forming three sections of coiled coil.MaTf was a hydrophilic protein with TR_FER structures in the N and C terminals.

Monochamus alternatus；transferrin；bioinformatics；domain

S476.9；Q789

A

1004-874X（2016）04-0117-07

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.023

2015-12-19

廣東省自然科學基金（1414050001666）

蔡紫玲（1992-），女，在讀碩士生，E-mail:1274800271@qq.com

林同（1969-），男，博士，副教授，E-mail: lintong@scau.edu.cn