膀胱癌組織中細(xì)胞周期蛋白D1和基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

牛俊豪　王俊勇　張　君　張　凱　范　銳

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院泌尿外科二病區(qū)，河南　鄭州　450000)

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膀胱癌組織中細(xì)胞周期蛋白D1和基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

牛俊豪王俊勇張君張凱范銳

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院泌尿外科二病區(qū)，河南鄭州450000)

〔摘要〕目的探討膀胱癌組織中細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性。方法2010年7月至2015年1月來該院就診的膀胱癌患者的膀胱癌組織及癌旁組織各62例，另取同期的膀胱囊腫患者術(shù)后正常膀胱組織60例進(jìn)行對照，檢測cyclin D1和MMP-2在各組的表達(dá)，記錄并對比結(jié)果后分析二者的表達(dá)與其病理特征關(guān)系。結(jié)果膀胱癌組織的cyclin D1 mRNA與MMP-2 mRNA表達(dá)顯著高于正常組織及癌旁組織的表達(dá)(P<0.05)。癌癥分期為T2～T4期的cyclin D1及MMP-2基因的表達(dá)水平顯著高于Tis～T1期，癌癥分級為Ⅲ級的cyclin D1及MMP-2基因的表達(dá)水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ級(P<0.05)。腫瘤直徑>3 cm的cyclin D1 mRNA表達(dá)顯著高于≤3 cm者，腫瘤分級為Ⅲ級的cyclin D1 mRNA及MMP-2 mRNA 顯著高于Ⅰ～Ⅱ級者，腫瘤分期為T2～T4期的cyclin D1 mRNA及MMP-2 mRNA 顯著高于Tis～T1者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的cyclin D1 mRNA及MMP-2 mRNA 顯著高于無轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織cyclin D1 mRNA表達(dá)與腫瘤直徑、分級、分期以及淋巴結(jié)呈正相關(guān)，MMP-2 mRNA表達(dá)與腫瘤分級、分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。結(jié)論膀胱癌組織中cyclin D1和MMP-2的表達(dá)及其與臨床病理特征具有緊密的聯(lián)系，因此在臨床可考慮通過監(jiān)測二者的表達(dá)以掌握患者的病情進(jìn)展。

〔關(guān)鍵詞〕膀胱癌組織；細(xì)胞周期蛋白D；基質(zhì)金屬蛋白酶2

膀胱癌發(fā)病年齡不受任何限制〔1〕，多項(xiàng)研究表明，細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)過度表達(dá)會造成細(xì)胞失控進(jìn)而發(fā)生癌變，而被激活的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2可引發(fā)腫瘤向外部侵襲以及轉(zhuǎn)移，可通過檢測該兩項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)情況來診斷及預(yù)測患者病情轉(zhuǎn)歸情況〔2〕。本文旨在研究膀胱癌組織中cyclin D1和MMP-2的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料2010年7月至2015年1月來我院就診的膀胱癌患者的膀胱癌組織以及癌旁組織各62例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)單純膀胱病變；(2)年齡>42歲；(3)患者的疾病資料數(shù)據(jù)完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有其他種類的原發(fā)性癌癥；(2)心、肝、腎等重要臟器發(fā)生功能異常。其中男75例，女49例；年齡42～78〔平均(63.6±2.6)〕歲。病程6個月～3年，平均(1.2±0.5)年。膀胱癌的分期與分級標(biāo)準(zhǔn)分別根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)以及WHO分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分〔3〕，其中Tis～T1期34例，T2～T4期28例；Ⅰ～Ⅱ級36例，Ⅲ級26例。另取同期的膀胱囊腫患者術(shù)后正常膀胱組織60例進(jìn)行對照，男42例，女18例；年齡40～75〔平均(63.2±2.7)〕歲。各組患者的年齡及性別等資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。本次研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，患者也均知情同意。

1.2研究方法(1)檢測cyclin D1及MMP-2 mRNA表達(dá)將組織標(biāo)本進(jìn)行剪碎制成勻漿之后，利用Trizol試劑提取樣本的總RNA，再用產(chǎn)自美國的Nanodrop ND-2000型超微量核酸蛋白檢測儀對RNA的濃度和純度實(shí)施檢測。通過MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶使總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增cyclin D1和MMP-2，以及內(nèi)參β-actin基因。將6 μl的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖進(jìn)行電泳分離，利用tanonGIS凝膠成像相關(guān)系統(tǒng)實(shí)施密度指數(shù)分析。將β-actin作內(nèi)參，用cyclin D1和MMP-2 mRNA的密度指數(shù)與內(nèi)參密度指數(shù)比記錄二者的相對表達(dá)量。(2)檢測cyclinD1和MMP-2蛋白表達(dá)：提取出組織總蛋白，通過Brandford法檢測總蛋白濃度，將20 μg/孔總蛋白經(jīng)10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)行電泳分離，在4℃及90 mA恒流下轉(zhuǎn)膜過夜。完成后，取聚偏氟丙烯(PVDF)膜于5%脫脂牛奶內(nèi)行1 h的室溫封閉。使膜于兔單克隆抗體cyclin D1(1∶400)和MMP-2(1∶200)以及多克隆抗體GAPDH(1∶1 000)的比例稀釋。在室溫下行2 h搖床孵育，利用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG經(jīng)1∶5 000的比例稀釋，在相同條件下孵育1 h，完成后經(jīng)Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)行3次漂洗，10 min/次，通過化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑將陽性條帶予以顯示。記錄并對比結(jié)果后分析膀胱癌組織cyclin D1和MMP-2 mRNA表達(dá)與其病理特征的關(guān)系。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同膀胱組織的cyclin D1 mRNA及MMP-2 mRNA表達(dá)情況比較 膀胱癌組織的cyclin D1 mRNA與MMP-2 mRNA表達(dá)顯著高于正常組織及癌旁組織(P<0.05)。見表1。

2.2膀胱癌組織cyclin D1 mRNA和MMP-2 mRNA表達(dá)與其病理特征關(guān)系分析見表2。腫瘤直徑>3 cm的cyclin D1 mRNA表達(dá)顯著高于≤3 cm者，腫瘤分級為Ⅲ的cyclinD1 mRNA及MMP-2 mRNA 顯著高于Ⅰ～Ⅱ者，腫瘤分期為T2～T4期的cyclin D1 mRNA及MMP-2 mRNA 顯著高于Tis～T1期者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的cyclin D1 mRNA及MMP-2 mRNA 顯著高于無轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。

表1　不同膀胱組織的cyclin D1 mRNA及MMP-2 mRNA表達(dá)情況比較〔 n(%)〕

與膀胱癌組織比較：1)P<0.05

表2　膀胱癌組織cyclin D1 mRNA和MMP-2 mRNA表達(dá)與病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

與腫瘤直徑≤3 cm比較：1)P<0.05；與Ⅰ～Ⅱ級比較：2)P<0.05；與Tis～T1期比較：3)P<0.05；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較：4)P<0.05

2.3不同分期與分級的膀胱癌組織中cyclin D1及MMP-2基因表達(dá)比較癌癥分期為T2～T4期的cyclin D1及MMP-2基因的表達(dá)水平(0.881±0.126,0.912±0.203)顯著高于Tis-T1期(0.574±0.103,0.627±0.086)，癌癥分級為Ⅲ級的cyclin D1及MMP-2基因的表達(dá)水平(1.133±0.119,1.258±0.105)顯著高于Ⅰ～Ⅱ級(0.767±0.083,0.859±0.127)(P<0.05)。

2.4膀胱癌組織cyclin D1 mRNA和MMP-2 mRNA表達(dá)與其病理特征的相關(guān)性分析根據(jù)表3進(jìn)行相關(guān)性分析，膀胱癌組織cyclin D1 mRNA表達(dá)與腫瘤直徑、分級、分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(r=0.589，0.625，0.607，0.724；均P<0.05)。MMP-2 mRNA表達(dá)與腫瘤分級、分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(r=0.636，0.709，0.648；均P<0.05)。

3討論

腫瘤自發(fā)生到發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移，各個階段均非常復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以及分子生物學(xué)均致力于腫瘤相關(guān)研究。專家學(xué)者們在對腫瘤進(jìn)行觀察研究中發(fā)現(xiàn)，其不協(xié)調(diào)性生長以及增生活動等過程，均有相應(yīng)的具有調(diào)控細(xì)胞周期功能的蛋白參與，由此可以得出，腫瘤的發(fā)生及發(fā)展和細(xì)胞周期出現(xiàn)調(diào)控失常現(xiàn)象存在十分重要的聯(lián)系〔4〕。其中，cyclin D1為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)因子中典型的一種，其表達(dá)情況可直接體現(xiàn)多類原發(fā)性腫瘤臨床特點(diǎn)。同時，實(shí)驗(yàn)研究表明，MMPs對于腫瘤侵襲以及發(fā)生轉(zhuǎn)移等均起到非常重要的作用。主要是由于MMPs幾乎可以降解細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)各類蛋白成分，并且能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞所侵襲的各個組織學(xué)屏障進(jìn)行破壞，因此，該物質(zhì)的表達(dá)情況對腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的提示意義逐漸得到重視〔5〕。MMP-2因特殊的結(jié)構(gòu)而區(qū)別于其他MMPs，認(rèn)為其在酶解過程中所發(fā)揮的作用十分關(guān)鍵。

本研究結(jié)果表明膀胱癌組織中cyclin D1和MMP-2的表達(dá)能夠在較大程度上反映腫瘤患者的病情癥狀，有利于盡早進(jìn)行診斷與治療。考慮原因可能是正常細(xì)胞的周期可分成4個階段，且受到3類因子精確調(diào)控〔6〕。然而腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有周期調(diào)控作用的因子常表現(xiàn)為過度表達(dá)，且比較典型的調(diào)控因子為cyclin D1。cyclin D1屬于周期蛋白，其能夠?qū)椭芷诘鞍紫嚓P(guān)的依賴性激酶實(shí)施調(diào)控，主要作用為促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行增殖。具體體現(xiàn)為cyclin D1可以和G1期所獨(dú)有的周期蛋白相結(jié)合，所得復(fù)合物以該兩種蛋白調(diào)節(jié)亞基形式存在，被激活后可和G1期腫瘤抑制類蛋白Rb進(jìn)行相互作用，促進(jìn)細(xì)胞周期自G1期過渡到S期，且被積極調(diào)控表達(dá)。因此，當(dāng)cyclin D1過度表達(dá)時，細(xì)胞增殖會表現(xiàn)為失控狀態(tài)，甚至惡性化，因此醫(yī)學(xué)上將其公認(rèn)為一項(xiàng)原癌基因。而MMP-2為基質(zhì)進(jìn)行降解時所需的一種重要蛋白水解酶，屬于MMPs家族，并且是其中非常關(guān)鍵的一員。MMP-2基因排列位置在染色體16q21，其組成成分中外顯子以及內(nèi)含子數(shù)量分別為13和12。MMP-2分泌時為酶原狀態(tài)，當(dāng)其被激活活化之后，可對接近腫瘤表面位置的細(xì)胞間基質(zhì)進(jìn)行破壞作用。此活動導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠順沿已缺失的基質(zhì)膜，浸潤附近組織及器官等，進(jìn)而造成腫瘤進(jìn)一步侵襲以及轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。 張金平等〔7〕研究指出，MMP-2被活化之后，定位在穿透基質(zhì)最突出位置，使得活化的MMP-2在對細(xì)胞間基質(zhì)和基底膜等酶解活動中起到關(guān)鍵性作用。

綜上，膀胱癌組織中cyclin D1和MMP-2的表達(dá)及其與臨床病理特征具有緊密的聯(lián)系，因此在臨床可考慮通過監(jiān)測二者的表達(dá)以掌握患者的病情進(jìn)展。

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〔2015-07-13修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3210-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.056

第一作者：牛俊豪(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事泌尿外科研究。