甲狀腺乳頭狀癌組織中核轉錄因子-κB的表達及其與臨床病理特征的關系

張振華　張榮明

(河南省人民醫院甲狀腺外科，河南　鄭州　450003)

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甲狀腺乳頭狀癌組織中核轉錄因子-κB的表達及其與臨床病理特征的關系

張振華張榮明1

(河南省人民醫院甲狀腺外科，河南鄭州450003)

〔摘要〕目的探討甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中NF-κB的表達及其與臨床病理特征的相關性。方法隨機選擇2013年2月至2015年6月于該院采取手術治療的PTC患者68例。取PTC癌組織以及對應的癌旁組織分別進行逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測、Western印跡檢測以及免疫組化檢測；分析NF-κB表達與PTC患者病理特征的相關性。結果NF-κB mRNA及NF-κB 蛋白在PTC癌組織中的表達率顯著高于癌旁組織(P<0.05)。PTC癌組織的NF-κB /β-actin mRNA 以及NF-κB蛋白/GAPDH的灰度比值顯著高于癌旁組織(P<0.05)。NF-κB陽性表達在PTC癌組織中主要為陽性及強陽性，而在癌旁組織中則主要為弱陽性，組間差異顯著(P<0.05)。 相關性分析發現，NF-κB陽性表達與PTC患者的腫瘤直徑、頸淋巴結轉移以及TNM分期均呈正相關(r=0.667，0.709，0.691；均P<0.05)。結論NF-κB在PTC患者組織中呈高表達，且NF-κB的高表達與PTC患者臨床病理特征聯系密切，在PTC患者疾病進展中扮演著重要的角色。

〔關鍵詞〕甲狀腺乳頭狀癌；核轉錄因子-κB

乳頭狀甲狀腺癌(PTC)發病率較高，癌灶易發生浸潤和轉移〔1〕。核轉錄因子(NF)-κB在機體免疫反應以及炎性反應等多個反應階段中均起到調控作用。有報道指出NF-κB有助于及時掌握腫瘤患者癌灶轉移以及疾病轉歸等情況〔2〕。本文旨在探討NF-κB與臨床病理特征的關系。

1資料和方法

1.1臨床資料隨機選擇2013年2月至2015年6月于我院采取手術治療的PTC患者68例，男31例，女37例，年齡41～72〔平均(57.6±1.9)〕歲。TNM分期Ⅰ～Ⅱ 38例，Ⅲ～Ⅳ期 30例。術中切除的PTC癌組織及對應的癌旁組織均保存完整，入選標準：(1)患者的疾病診斷與手術方案均符合世界衛生組織關于PTC的定義與標準；(2)術前并未給予患者放、化療或免疫制劑類藥物治療。排除標準：(1)其他種類癌癥；(2)非手術治療的PTC患者。

1.2研究方法

1.2.1RT-PCR檢測取PTC癌組織以及對應的癌旁組織各0.1 g分別加進1 ml的TRIzol試劑中提取出組織總RNA。再將1 μg的RNA模板經購于Promega公司的反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。將β-actin作為內參，使用TaKaRa公司生產的RT-PCR試劑盒測定NF-κB mRNA的表達量。另取10 μl的RT-PCR擴增產物增添2 μl的6×Loading Buffer，利用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，在GDS800型凝膠成像系統中成像，對所得圖像進行灰度分析。其中NF-κB 的擴增引物是5′-AACTGTTCCCCCTCATCTTC-3′及5′-TCCTACAAGCTCGTGGGGGT-3′(269 bp)。β-actin的擴增引物是5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′及5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′(498 bp)。相關反應條件為94℃ 5 min，94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，循環35次，在72℃下延伸約10 min。

1.2.2Western印跡檢測取PTC癌組織及癌旁組織各0.1 g，在勻漿離心之后取其上清液，利用考馬斯亮藍G-250檢測核蛋白水平，調整至5 μg/L，在-70℃下保存備用。為每個泳道取50 μg的核蛋白，由聚丙烯酰胺凝膠行電泳分離，并電轉到PVDF膜。在封閉后，首先加入兔抗人NF-κB型單克隆抗體，而后添加與辣根過氧化物酶相結合的驢抗兔型二抗，利用化學發光試劑盒對雜交信號進行檢測。將GAPDH作為內參，通過分析軟件給予灰度分析。

1.2.3免疫組化檢測使用SP法測定NF-κB的表達情況。4%的多聚甲醛對標本進行固定，經石蠟包埋，切片厚度4 μm，在脫蠟及水化組織切片后，利用0.1%的枸緣酸鹽緩沖液行抗原熱修復，再進行SP免疫組化染色。使用二甲苯中性樹脂進行封固，在顯微鏡下進行觀察。將PBS代替一抗用于陰性對照。將胞質/胞核呈現黃色或棕黃色，以及棕褐色顆粒視為陽性。為每張切片選取5個視野(400×)實施染色細胞評分，染色細胞數在計數細胞中占比<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分。染色強度：無染色計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。二者乘積0分計陰性(-)，1～4分計弱陽性(+)，5～8分計陽性()，9～12分計強陽性()。

1.3統計學方法應用SPSS16.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、Pearson分析。

2結果

2.1NF-κB在不同組織中的表達情況NF-κB mRNA及NF-κB 蛋白在PTC癌組織中的表達率〔56例(82.35%)、58例(85.29%)〕顯著高于癌旁組織〔18例(26.47%)、23例(33.82%)〕(P<0.05)。

2.2兩組NF-κB /β-actin mRNA 以及NF-κB蛋白/GAPDH的灰度比值比較PTC癌組織的NF-κB /β-actin mRNA(0.91±0.13)以及NF-κB蛋白/GAPDH的灰度比值(9.44±0.38)顯著高于癌旁組織(0.38±0.15,1.83±0.25)(t=22.018,137.962,P<0.05)。

2.3不同組織免疫組化結果比較NF-κB陽性表達在PTC癌組織中主要為陽性及強陽性，陽性表達率為86.76%(-9例，+0例，32例，27例)，而在癌旁組織中則主要為弱陽性，陽性表達率為27.94%(-49例，+19例，及均為0例)，組間差異顯著(χ2=48.099,P<0.05)。

2.4NF-κB表達與PTC患者病理特征的關系腫瘤直徑≥1 cm、有頸淋巴結轉移以及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期者的NF-κB表達陽性率顯著高于腫瘤直徑<1 cm、無淋巴結轉移以及TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期者(P<0.05)。見表1。

表1　NF-κB表達與PTC患者病理特征的關系(n)

2.5NF-κB陽性表達與PTC患者病理特征的相關性分析根據表4分析相關性可知，NF-κB陽性表達與PTC患者的腫瘤直徑、頸淋巴結轉移以及TNM分期均呈正相關(r=0.667，0.709，0.691；均P<0.05)。

3討論

NF-κB屬于轉錄因子類型蛋白家族，人體細胞內含Rel、RelB、p65、p52及p50五種亞單位。p65、Rel以及RelB均具有N端同源區和具備反式激活功能的結構域C端，其中同源區中存在一個特定核定位區域，可與DNA相結合，并參與核易位以及二聚體化，而反式激活區域則和轉錄活化等相關聯〔3〕。NF-κB能夠參與人體細胞分化、凋亡，產生胚胎組織和免疫以及感染、發生腫瘤等生理性、病理性反應。已有報道，NF-κB在多種腫瘤細胞內存在異常高表達，進一步證實其對于腫瘤浸潤以及轉移等起到的重要作用〔4〕。

本研究結果充分說明了NF-κB在癌組織中具有更高的表達量。由于NF-κB屬于早期型轉錄因子，其激活無需新翻譯蛋白給予調控，當細胞受到有害刺激時，其能夠立即給予反應〔5〕。因此，當細胞膜表面出現有害刺激和受體相結合情況時，可以使NF-κB自身信號通路發生改變，進而表達。而PTC組織內通常具有大量炎性因子，且其微環境通常處于缺氧狀態，因此會刺激NF-κB活化，并向核內部轉移〔6〕。病毒編碼類型癌蛋白也會導致NF-κB激活，進而造成患者NF-κB水平高表達。NF-κB自身通路激活能夠促進腫瘤細胞發生以及發展，進一步印證其對腫瘤癌變所起到的關鍵作用。主要表現為NF-κB活化高表達，其抗凋亡通路得到充分表達，能夠使細胞凋亡因子以及周期調節類蛋白表達水平受到抑制而呈低表達狀態，導致腫瘤細胞避免了凋亡機制，形成克隆能力而不斷增殖〔7〕。Lin等〔8〕報道提出，血管內皮生長因子是能夠促進血管不斷形成的因子，其對于腫瘤發生以及轉移均起到關鍵作用。而NF-κB對于其具有明顯調控作用，當NF-κB水平上升時，其水平得到顯著上調，造成腫瘤血管大量形成，且NF-κB激活之后還會導致控制PTC發生高轉移的細胞因子表達水平上升，進而促進癌細胞轉移。因此，NF-κB激活直接影響PTC的生長及轉移。同時，相關性分析結果再次表明NF-κB陽性表達與患者的臨床病理特征存在較大的聯系，值得深入研究。

4參考文獻

1樊玉霞，劉洋，劉征，等.核轉錄因子-κB信號通路對甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學行為的影響〔J〕.中華實驗外科雜志，2015；32(8)：1866-8.

2石建華，汪萬英，李陽，等.MMP-9、TIMP-1和NF-κB在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義〔J〕.中華內分泌代謝雜志，2010；26(2)：129-31.

3何雅靜，孟召偉，譚建，等.小干擾RNA抑制核因子-κB增強131I治療甲狀腺癌療效的研究〔J〕.中華核醫學與分子影像雜志，2013；33(3)：207-12.

4董鴻，晏昱婧，沈文狀，等.兒童及青少年甲狀腺癌特點及頸淋巴結轉移風險因素探討〔J〕.現代生物醫學進展，2015；15(18)：3544-7.

5Pyo JS，Sohn JH，Kang G，etal.Characteristics of neck level Ⅳ lymph nodes in papillary thyroid carcinoma：correlation between nodal characteristics and primary tumor〔J〕.Endocr Pathol，2015；26(1)：15-20.

6Pyo JS，Kang G，Kim DH，etal.Activation of nuclear factor-κB contributes to growth and aggressiveness of papillary thyroid carcinoma〔J〕.Pathol Res Pract，2013；209(4)：228-32.

7Bommarito A，Richiusa P，Carissimi E，etal.BRAFV600E mutation，TIMP-1 upregulation，and NF-κB activation：closing the loop on the papillary thyroid cancer trilogy〔J〕.Endocr Relat Cancer，2011；18(6)：669-85.

8Lin CI，Du J，Shen WT，etal.Mitogen-inducible gene-6 is a multifunctional adaptor protein with tumor suppressor-like activity in papillary thyroid cancer〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2011；96(3)：E554-65.

〔2015-12-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項目：遼寧省自然科學基金項目(No.2014022035)

通訊作者：張榮明(1974-)，男，碩士，教授，主要從事燒傷整形研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3198-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.050

1遼寧醫學院第一附屬醫院

第一作者：張振華(1974-)，男，碩士，主治醫師，主要從事甲狀腺外科研究。