龜鹿二仙膏對人子宮內膜基質增殖及纖維連接蛋白表達的影響

尚　冰　叢培瑋　王軼蓉　吳兆利

(遼寧中醫藥大學中醫文獻研究院,遼寧　沈陽　110847)

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龜鹿二仙膏對人子宮內膜基質增殖及纖維連接蛋白表達的影響

尚冰叢培瑋1王軼蓉2吳兆利3

(遼寧中醫藥大學中醫文獻研究院,遼寧沈陽110847)

〔摘要〕目的觀察龜鹿二仙膏對人子宮內膜基質細胞(hESCs)增殖功能，纖維連接蛋白(FN)表達的影響。方法體外培養hESCs，細胞貼壁達75%后對細胞純度通過免疫組化法進行鑒定。實驗分成對照組、10-4mol/L龜鹿二仙膏組、10-6mol/L龜鹿二仙膏組、10-8mol/L龜鹿二仙膏組及雌二醇組，各組細胞無血清培養同步化24 h后，選取24 h、36 h、48 h分別處理細胞。應用MTT比色法檢測細胞增殖率；Real-time PCR法檢測細胞FN基因的相對表達量；Western 印跡法檢測細胞FN蛋白含量。結果細胞波形蛋白鑒定陽性率達95%。龜鹿二仙膏含藥血清對hESCs增殖呈時間及劑量依賴性，10-4mol/L龜鹿二仙膏組在培養36 h、48 h后能顯著上調細胞增殖率。FN mRNA及蛋白表達在10-4mol/L龜鹿二仙膏組作用72 h后上升最為顯著，明顯高于對照組(P<0.01)，且與雌二醇組間比較無統計學差異(P>0.05)。結論10-4mol/L龜鹿二仙膏可顯著促進hESCs增殖，且呈時間及劑量依賴性?？稍诜肿铀缴险{FN 表達，可能與其治療女性生殖健康機制相關。

〔關鍵詞〕龜鹿二仙膏；子宮內膜基質細胞；纖維連接蛋白；雌二醇

龜鹿二仙膏是著名的抗衰老膏方，由鹿角膠、龜板膠、枸杞子、人參組成，具有生精、益氣、養血的功效，古醫籍中多見有運用該方調理女性健康。現代臨床文獻報道稱龜鹿二仙膏對改善女性血液循環，提高性激素含量有顯著療效〔1，2〕。但未見有本方針對女性生殖健康調理和疾病治療的臨床及實驗研究。子宮內膜是一個由激素調節，經歷動態改變的組織，在性激素的作用下，內膜細胞發生周期性的變化。人體性腺激素和生物活性分子通過介導細胞-細胞或細胞-基質間的聯系，調節子宮內膜容受性的形成，促進子宮內膜-囊胚間的對話，保證囊胚的正常植入〔3〕。子宮內膜對性腺激素的反應是女性子宮生殖能力的重要體現。本研究探討龜鹿二仙膏對人子宮內膜基質增殖細胞(hESCs)及纖維連接蛋白(FM)表達的影響。

1材料和方法

1.1材料來源選取2014年5～11月遼寧中醫藥大學附屬醫院婦產科因婦科良性疾病行腹腔鏡檢查患者15例，年齡25～45歲，術后病理顯示為正常增生期子宮內膜，術前3個月未應用過激素類藥物，刮宮獲取足夠數量的子宮內膜，轉移至4℃保存的裝有細胞培養液的小瓶中，將小瓶置于低溫保溫桶內0.5 h內送至實驗室，所取標本均與患者簽署知情同意書。

1.2藥品及試劑龜鹿二仙膏(上海中醫藥大學附屬岳陽醫院藥局制)；DMEM-F12培養液、胎牛血清(Hyclone)；青鏈霉素混合液(Genview)；膠原酶、人雌二醇(Sigma)；兔抗人波形蛋白抗體；兔抗人FN一抗、鼠抗人β-肌動蛋白(β-actin)一抗(Santa)；RNA反轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒(TaKaRa)。

1.3主要儀器Heal Fore Neofuge13 臺式高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司)；TU-1810PC型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；MycyclerTMThermal CyclerPCR擴增儀(BIO-RAD)；EPS天能電泳儀(上海天能科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1組織處理與細胞培養參照Arnold等〔4〕法分離并獲取hESCs。超凈工作臺取出內膜組織，無菌培養皿中PBS洗3遍。剪至1 mm3碎片，置0.125%膠原酶，37℃消化60 min，每5 min拍打一次，培養液終止消化。38μm不銹鋼網過濾，離心1 200 r/min，15 min，收集細胞，接種在10%FBS D-F12培養瓶中(5×105～6×105/ml)，37℃、5%CO2，飽和濕度培養箱培養，24 h換液，細胞貼壁達90%以上后1∶3傳代。

1.4.2含藥血清的制備取SD雄性大鼠20只，隨機分為2組，每組10只。龜鹿二仙膏組灌胃給藥量按成人日臨床劑量，經人/鼠體表面積換算為成人劑量，2次/d，每次3.5 ml(含生藥量為2.64 g/ml)，7 d。對照組大鼠每天灌服等量生理鹽水。末次給藥1 h后股動脈取血，分離血清，56℃恒溫30 min滅活補體，過濾分裝，-20℃短期保存備用。按以上方法用同體積生理鹽水灌胃，制備生理鹽水血清，用作對照。

1.4.3細胞分組與處理取第2代hESCs，胰酶消化，細胞貼壁達75%以上后接種于24孔板，無血清同步化培養24 h后棄培養液，分設對照組、10-4mol/L龜鹿二仙膏組、10-6mol/L龜鹿二仙膏組、10-8mol/L龜鹿二仙膏組及雌二醇組。對照組加入對照血清培養液；不同劑量龜鹿二仙膏組按培養液所含含藥血清濃度，設10-4mol/L、10-6mol/L、10-8mol/L 3個劑量組；雌二醇組加入10-6mol/L雌二醇培養液。每組8孔，每孔3復孔。37℃、5%CO2，飽和濕度培養箱分別培養24 h、36 h、48 h。

1.4.4Real-time PCR測定FN mRNA表達按實驗分組處理細胞，分別在24 h、36 h、48 h收集細胞，RNAiso Plus 試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度。去除基因組DNA，反轉錄RT反應，SYBR Green I相對定量分析。反轉錄按如下條件反應：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。實時定量PCR反應條件：95℃ 10 s，95℃ 20 s，60℃ 35 s，32個循環。引物序列：FN基因上游5’-TAGCCCTGTCCAGGAGTTCA-3’,下游5’-CTGCAAGCCTTCAATAGTCA-3’；β-actin基因上游5’-GCACAGCCTGGATAGCA-3’,下游5’-CACCAACTGGGACGACAT-3’。

1.4.5Western 印跡測定FN蛋白含量按實驗分組處理細胞，分別在24 h、48 h、72h收集細胞，提取總蛋白，BCA法蛋白定量。每孔80 μg蛋白150 V恒壓電泳30 min，半干轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫搖床封閉2h，加入兔抗IGF-1(或FN)一抗(1∶100)，4℃過夜。TBST洗膜3次，15 min/次；二抗常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，15 min/次，化學發光法顯影。

1.5統計學處理應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2結果

2.1龜鹿二仙膏對FN mRNA表達的影響與對照組比較，24、36、48 h FN mRNA的表達均有不同程度的升高(P<0.05，P<0.01)，且呈時間及劑量依賴性。而10-4mol/L龜鹿二仙膏組作用hESCs 48 h后FN mRNA的表達升高最為顯著(P<0.01)，與雌二醇組比較無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1　不同時間各組hESCs中FN mRNA表達變化

與對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與雌二醇組比較：3)P<0.05,4)P<0.01;與10-4mol/L龜鹿二仙膏組比較：5)P<0.05；6)P<0.01；下表同

2.2龜鹿二仙膏對FN蛋白表達的影響與對照組比較，24、36、48 h FN mRNA的表達均有不同程度的升高(P<0.05，P<0.01)，且呈時間及劑量依賴性。10-4mol/L龜鹿二仙膏組作用hESCs 48 h，對FN蛋白的表達促進作用最為顯著(P<0.01)，與雌二醇組間比較無統計學差異。見表2，圖1。

表2　不同時間各組大鼠子宮內膜基質細胞FN蛋白表達變化

1：對照組；2：10-8 mol/L龜鹿二仙膏組；3：10-6 mol/L龜鹿二仙膏組；4：10-4mol/L龜鹿二仙膏組；5：10-6mol/L雌二醇組圖1　龜鹿二仙膏對FN蛋白表達的影響

3討論

生殖健康與提高生命質量密切相關雌激素替代療法被認為是治療圍絕經期女性疾病及亞健康調理的有效方法，但雌激素長期應用的依從性較差，時期應用受到一定限制〔5〕。雌激素替代療法的副作用一直是醫學界爭論的焦點，中醫養生調理在促進生殖健康以及亞健康干預中顯示了其獨特的優勢和作用。

龜鹿二仙膏是古代著名填精益髓，益氣養血之膏方。其方首見于《醫方考·虛損勞瘵門》，因符合女性生理和病理特點，龜鹿二仙膏為許多著名中醫婦科專家臨床應用于女性健康調理。方中鹿角膠甘咸而性溫，功善溫腎壯陽補益精血。龜板膠甘咸而性寒，長于填補精髓滋養陰血，二味能峻補陰陽以生氣血精髓共為君藥。配伍人參補后天脾胃之中氣，以增強化生氣血之源。枸杞子益肝腎補精血以助龜、鹿之功均為臣藥。四藥為伍陰陽并補氣血兼顧共成陰陽氣血交補之劑具有滋陰填精、益氣壯陽之功。劉同祥等〔6〕發現給大鼠灌胃服藥10 d后，前列腺和精囊腺的重量均有所增加。俞麗霞〔7〕研究證實龜鹿二仙膏能明顯增加未成年小鼠、大鼠和去勢大鼠包皮腺、精液囊和前列腺重量，升高去勢雄性大鼠血清皋酮水平和腎陽虛小鼠血中cMAP、GMP含量及脾細胞脫氧核糖核酸合成率，能有效防治腎陽虛小鼠附性器官萎縮，提高去勢大鼠陰莖電刺激興奮性，明顯縮短大鼠交配撲捉和射精潛伏期。

子宮內膜在性激素的作用下發生周期性的變化，性激素能促進子宮內膜上皮細胞有絲分裂，促進上皮細胞增殖，引起子宮內膜基底層和腺體、間質、血管增生、增厚〔8〕。而基質細胞在上皮細胞的發育、生長和功能方面發揮著重要的調節作用，其還有可能參與性激素對上皮細胞的增殖作用〔9〕。子宮內膜對性腺激素的反應是女性子宮生殖能力的重要體現。FN廣泛存在于細胞外基質、基底膜及各種體液中，通過與細胞膜上相應的整合素蛋白結合介導細胞與細胞外基質間的黏附，調控細胞遷移、增殖及分化等過程，在胚胎植入和妊娠的維持中發揮重要作用，并廣泛參與組織損傷的修復、感染性炎癥的發生及白細胞浸潤炎癥組織等活動〔10〕。一系列研究顯示，IGF-1可通過與其受體結合誘導FN表達，阻止FN與細胞結合進而抑制細胞有絲分裂作用〔11〕。動物研究顯示〔12〕雌激素通過改變子宮內膜FN含量可能是其調控胚泡著床的機制之一，與卵巢激素、細胞因子等形成復雜的網絡系統，共同參與女性生殖生理調節。本項目前期臨床實驗顯示，龜鹿二仙膏對圍絕經期綜合征女性患者治愈率高達93.75%〔13〕，但龜鹿二仙膏對人子宮內膜雌激素靶基因FN表達影響的研究尚屬空白。

本文結果提示10-4mol/L龜鹿二仙膏能夠顯著上調及標志性功能蛋白水平，其可能通過上調FN表達，促進子宮內膜基質細胞的增殖率，進而促進子宮內膜血管增生、增厚，提高女性生殖能力恢復。本研究繼承和挖掘古代傳統膏方在女性健康方面的應用潛力，旨在為中醫膏方應用于女性健康維護和亞健康干預提供科學實驗依據，至于是否具有其他影響機制，有待進一步研究。

4參考文獻

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〔2015-10-17修回〕

(編輯曹夢園)

基金項目：遼寧省科技廳科技攻關層次計劃項目(2012225018)

通訊作者：吳兆利(1965-)，女，醫學博士，教授，碩士生導師，主要從事中醫藥對臟腑調控作用的信號轉導機制研究。

〔中圖分類號〕R274

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3135-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.018

1遼寧中醫藥大學教學實驗中心2遼寧中醫藥大學附屬醫院婦產科

3遼寧中醫藥大學針灸推拿學院

第一作者：尚冰(1974-)，男， 副教授，醫學博士，主要從事中醫藥對臟腑調控作用的信號轉導機制研究。