顯微錄像系統觀察川芎嗪對血瘀證家兔的活血化瘀作用

張紅兵　趙國茂　仇艷光　狄柯坪

(河北經貿大學生物科學與工程學院食品質量安全研究所，河北　石家莊　050061)

?

顯微錄像系統觀察川芎嗪對血瘀證家兔的活血化瘀作用

張紅兵趙國茂1仇艷光2狄柯坪2

(河北經貿大學生物科學與工程學院食品質量安全研究所，河北石家莊050061)

〔摘要〕目的在活體情況下，用攝錄像系統顯微觀察川芎嗪對實驗性血瘀證家兔腸系膜微血管微循環的影響。方法采用活體恒溫微循環灌流結合顯微錄像電視放大技術，分別觀測血瘀證前后家兔腸系膜微血管口徑、血流速度、單位面積腸系膜血流量、微血管開放數量、白細胞與血管內皮細胞黏附力變化、血液流動狀態等的改變以及川芎嗪對上述指標的影響。結果川芎嗪可以通過改善血流狀態、擴張血瘀癥時縮小的微血管管徑，增加微血管的開放數量，加快微血管內血流速度，減少白細胞黏附和組織液的生成等多種方式，改善局部缺血狀態增加微循環灌注。結論改善腸系膜微循環、增加血液灌注是川芎嗪發揮活血化瘀作用的病理基礎。

〔關鍵詞〕川芎嗪；血瘀證；微循環

傳統中醫學認為血瘀證對人體危害很大〔1〕。川芎嗪作為活血化瘀藥有很好的療效，但作用機制仍不明。以往實驗多針對離體標本的血液流變學測量，直觀性差，缺乏活體動態描述。本實驗采用顯微電視錄像靜畫步進法，在活體中定量測定川芎嗪對血瘀證前后腸系膜同一支微動脈內血管內徑、血流速度、血流量的影響，觀察同一支微靜脈內白細胞流動狀態的變化，可綜合反映神經、體液等整體方面動態，以便更好解釋中藥多層次多靶點發揮藥效的機制。

1材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器成年健康雄性大耳白家兔18只，體重2.0～2.5 kg，由河北醫科大學實驗動物部提供(動物證號：SCXK〔冀〕2008-1-003)，實驗前自由飲水，禁食48 h。川芎嗪注射液(20 mg/ml)由北京第四制藥廠提供，0.9%生理鹽水注射液(河北醫科大學第二附屬醫院制劑室)。Olympus倒置顯微鏡(CK2型)，JVC攝錄放像機(HR-D337MS型)，時間發生器(VTG-33型)，Nikon四道生理記錄儀(WI-641GC型)，腸系膜固定環(中國沈陽)，閉路循環式雙層恒溫微循環灌流盒(中國航天第606研究所)。

1.2動物模型復制18只實驗家兔隨機分為對照組、血瘀證模型組和川芎嗪組，每組各6只。采用改良的Rosata法對除對照組外家兔分別在非嚴格無菌條件下行闌尾切除術，常規逐層關腹，術后腹腔內發炎，證明血瘀證模型制作成功。分別在術前30 min、術后即刻、術后12 h按照10滴/min的速度靜脈點滴0.9%生理鹽水35 ml，川芎嗪組同時按0.1 ml/kg補加川芎嗪注射液。12 h后再按原切口打開腹腔，嚴格按照腸系膜微循環觀察法，同步觀察并錄制血瘀證后腸系膜微循環改變及川芎嗪對血流動力學指標造成的影響。整個實驗過程中,控制室溫為22℃～26℃。

1.3腸系膜微循環觀察與指標測定

1.3.1觀察腸系膜微循環以25%的烏拉坦(0.75 g/kg)腹腔注射行基礎麻醉，氯醛酮(30 mg/kg)耳緣靜脈注射維持麻醉。氣管插管置家兔于自發呼吸狀態。右頸動脈插入聚氯乙烯導管,接血壓傳感器,將血壓顯示并記錄。在倒置顯微鏡上放置恒溫微循環灌流盒，并用37.5℃、pH7.35的Krebs-Ringe液預先充滿該灌流盒。打開家兔側腹，將一部分小腸暴露出體外,在距闌尾10 cm左右處選擇有細小血管走行、脂肪較少的腸系膜放置于灌流盒內，選擇沒有大血管的區域作為固定部位。在呼吸、血壓同步監測的情況下，用光學系統將腸系膜微血管網放大，觀察微循環狀態。用排氣法保證焦距的恒定和畫面的穩定，保證手術前后腸系膜微循環的觀察部位、范圍保持固定。

1.3.2測定微血管內徑用電視時間發生器將每隔10 ms時間的畫面疊加到放大550倍的監視器畫面上，用連接在倒置顯微鏡上的攝像機攝取微血管圖像并把該圖像反錄到錄像帶上。用錄放機播放速度調節功能鍵使血管圖像得到重現。在放大550倍的監視器再生畫面上,選擇管壁結構清楚的部位,用游標卡尺分別測出指定微血管內徑，取3次的平均值。

1.3.3觀測微血管內白細胞流態應用顯微錄像靜畫步進法，比較每隔10 ms時間疊加的畫面，檢測在60 s內通過選定微血管中央區域的每個白細胞流動狀態的改變以及此段血管中白細胞的附壁數量的變化，根據Zeintle公式，推算白細胞與內皮細胞間黏附力的改變〔2〕。觀察計數整個視野內滲出的白細胞數量。

1.3.4測定微血管內紅細胞血流速度與血液灌注量置光敏元件于微血管壁內徑處，采用兩點光電法測量微細動脈內的紅細胞移動速度。于監視器再生畫面中測量紅細胞每40 ms的移動距離，根據紅細胞血流速度的快慢，改變數據段的長短，依據血流速度和血流量換算公式，按照預定的程序進行信號分析，得出紅細胞的血流速度和血液灌注量。同時測定手術部位三支微血管的數據取其平均值。

1.4統計學方法采用 SPSS18.0 軟件行單因素方差分析和t檢驗。

2結果

2.1血瘀證發生后微循環狀態的改變血瘀證發生后微循環觀測視野變得比較模糊，說明微血管管壁結構遭到破壞，形成散在出血點，可能由于局部組織水腫以及纖維蛋白滲出有關。微循環內的血流狀態發生漸進性改變，由最初正常的軸流逐漸改變為線流、線粒流、鐘擺流甚至出現血流停滯現象。模型組10 μm以下腸系膜微動脈、微靜脈內的血流速度均降低，其中微動脈內的血流速度僅相當于血瘀前的45%，血流量相當于血瘀前的48%(見表1)；微靜脈內附壁滾動和黏附的白細胞數量逐漸增多，白細胞由軸流進入血流的邊流，組織局部滲出的白細胞數量增多。觀測視野內部分微血管處于關閉或管徑收縮狀態，微循環呈現缺血低灌注狀態。

表1　川芎嗪對血瘀證前后微循環的影響±s，n=3)

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.2川芎嗪改善血瘀證后微循環的低灌注狀態血瘀證發生后，腸系膜微血管內的血液灌注量下降為血瘀前的48%，川芎嗪可使其恢復到血瘀前73%的水平(見表1)。川芎嗪還可使因血瘀導致縮小的微血管重新舒張，以得到更多的血液灌注，血瘀時微動脈管徑縮小到正常時的45%，川芎嗪可使其逐步擴張，能恢復到正常值的75%(見圖1)。觀測還發現，血瘀癥后血流速度明顯減慢，與血瘀證模型組相比，川芎嗪組血流速度明顯加快，能恢復到正常值的79%左右。實驗中還發現血瘀證時白細胞附壁黏著增強，導致毛細血管嵌塞，影響血流狀態。川芎嗪雖然不影響正常動物微循環內的白細胞流態，但能明顯減少血瘀證時白細胞的附壁滾動和黏附，改變血流狀態。

圖1　川芎嗪舒張血瘀證后縮小的微血管(×400)

3討論

中醫學認為“血瘀”是血液瘀滯或停滯。血瘀證就是體內血液瘀滯于一定處所引起血脈瘀滯不暢，氣滯血瘀所致的各種有關臨床病證，不僅包括血瘀、氣瘀，也含有“津”(組織液)的瘀積和“液”(淋巴液)的瘀滯，是對循環代謝障礙一類疾病的病理概括，它與全身和局部微循環障礙有著密切的關系，可見如果把血瘀簡單等同于炎癥的看法是非常膚淺的。現代醫學認為血瘀證是由于血液循環障礙而造成的全身或局部組織器官供血供氧不足，引起水腫、變性、炎癥、增生、壞死、糜爛、潰瘍、萎縮及血栓、出血等多種病理變化，其本質是微循環障礙及血液流變性異常〔3〕。由于氣血津液是維持人體生命活動不可缺少的物質，所以血瘀證對人體危害甚大。

血瘀證發生時導致多種實驗室檢測指標的異常改變，僅憑某一指標的變化判斷血瘀證是否形成，很容易導致出現“百病皆有瘀，無病不活血”的傾向，背離了中醫辨證施治論治的精髓，也悖于臨床實際〔4〕。因此構建符合臨床實際應用的血瘀證診斷標準，明確血瘀證的微觀證據十分重要。

微循環是微動脈與微靜脈之間的微小血液循環及物質交換的場所，直接參與組織和細胞的物質、能量及信息傳遞，參與調節血液、淋巴液與組織液流動，類似于中醫“孫絡”，可運行氣血，輸精排濁，如出現病變可導致脈絡疲痹，氣血不通，臟腑失養。通常血瘀證與微循環障礙互相伴隨，與中醫學“有其內，必有其外”的理論一致〔5〕。本實驗選用腸系膜作為檢測對象，經過系統把活體腸系膜微血管網放大到400倍，可以清晰地分辨出紅細胞、白細胞和血管內皮細胞，具有精確度高、直觀性強、再現性好的優點，便于綜合考慮體內神經、體液、內分泌等方面的影響，使微循環研究步入細胞水平。這種定量測定可有效彌補定性判斷和主觀目測不足，對明確血瘀證的診斷提供新思路。

川芎嗪是中藥傘形科植物川芎的有效成分，其化學成分為四甲基吡嗪，目前已能人工合成并廣泛應用于臨床心腦血管疾病的治療。它具有擴張血管，抑制血小板聚集，降低血小板活性，減少血中丙二醛(MDA)，提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)水平，抑制H2O2釋放等多種功能。雖然以往的研究明確了川芎嗪活血化瘀作用的一些分子作用靶點和信號傳遞通路〔6〕，但由于過分強調局部的改變，對解釋中藥整體藥效發揮存在一定不足。

本實驗結果表明川芎嗪使原處于收縮狀態的微血管重新舒張，血瘀證部位微血管口徑增大，血瘀部位白細胞的游出減少，有利于組織液生成，減輕炎癥反應。其原因可能是瘀血激活了白細胞，使其與血管內皮細胞黏附性增強；川芎嗪減少了白細胞游出、降低了其生物活性，減弱了它與血管內皮細胞間的黏附力。川芎嗪加快微血管內血流速度，改善血流狀態，的作用機制究竟是由于川芎嗪增加了紅細胞變形性使血液黏度降低，還是因為血小板、白細胞狀態改變導致，還是兩者兼有？川芎嗪可以通過作用于毛細血管前括約肌，使原處于關閉或收縮狀態的微血管重新舒張，增加了腸系膜內微血管的開放數量，其機制與內分泌因素、第二信使的作用有關，但對于川芎嗪是通過內源性一氧化氮(NO)介導的，還是本身起到外源性NO的作用，也存在爭議〔7,8〕。

4參考文獻

1杜金行，李騰飛，史載祥. 血瘀證及活血化瘀臨床研究回顧與展望〔J〕. 中華中醫藥雜志,2012;27(9):2247-53.

2Zeintl H,Sack FU,Intaglietta M,etal. Computer assisted leukocyte adhesion measurement in intravital microscopy〔J〕. Int J Microcirc Clin Exp Sponsored Eur Soc Microcirc,1989;8(3):293-302.

3李莎莎，肖雪，王躍生，等. 血瘀證與活血化瘀研究進展〔J〕. 河南中醫學院學報,2009;24(1):102-4.

4陳可冀，徐浩. 活血化瘀方藥的合理應用與深入研究〔J〕. 中日友好醫院學報,2005;19(6):323-4.

5郭強中，李云英. 血瘀證研究進展〔J〕. 遼寧中醫藥大學學報,2012;14(8):45-50.

6狄柯坪，田慧竹，郝鳳琴. 川芎嗪對血管炎性增生的抑制作用〔J〕. 時珍國醫國藥,2013;24(10):2381-2.

7苗里寧，李紅，顧華，等. 川芎嗪對老齡鼠再灌注腎損傷中一氧化氮的作用研究〔J〕. 中國老年學雜志,2000;20(4):242-3.

8狄柯坪，杜軍英，田凱鋒，等. 川芎嗪對家兔腸系膜毛細血管前括約肌的作用〔J〕. 四川中醫,2002;20(1):10-2.

〔2014-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：河北省科技支撐計劃項目(11231005D-5)；河北省中醫藥管理局指令性計劃(No.2008082)；河北經貿大學校內科研項目(2015KYZ01)

通訊作者：狄柯坪(1971-)，女，博士，副教授，主要從事中草藥作用機制研究。

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3126-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.014

1解放軍第196旅醫院2解放軍白求恩醫務士官學校

第一作者：張紅兵(1966-)，女，博士，碩士生導師，副教授，主要從事生物化學與分子生物學研究。