針刺對抑郁癥大鼠海馬SNARE蛋白介導突觸前谷氨酸釋放的影響

樊　凌　趙蒨琦　呂愛平　許能貴　劉建華　李滋平　吳泰相　歐愛華　符文彬

(廣東省中醫院大針灸科，廣東　廣州　510120)

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針刺對抑郁癥大鼠海馬SNARE蛋白介導突觸前谷氨酸釋放的影響

樊凌趙蒨琦呂愛平1許能貴2劉建華李滋平吳泰相3歐愛華4符文彬

(廣東省中醫院大針灸科，廣東廣州510120)

〔摘要〕目的探討針刺對抑郁癥的治療作用及其可能的治療靶點。方法采用長期不可預見的溫和性刺激建立大鼠抑郁癥模型。成功造模后，給予利魯唑和針刺治療，觀察各組大鼠行為學的變化，測定海馬組織谷氨酸的含量變化；應用Western印跡和熒光定量PCR檢測突觸小體相關蛋白(SNAP)-25、突觸小泡膜相關蛋白(VAMP)1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1蛋白及相應mRNA表達。結果與空白組相比，應激后大鼠的活動能力、體重和蔗糖消耗量明顯下降(P<0.05)；海馬組織谷氨酸含量顯著升高(P<0.01)；而經利魯唑和針刺治療后，活動能力、體重和蔗糖消耗量升高；海馬組織谷氨酸含量下降。Western印跡和RT-PCR結果顯示：模型組大鼠的SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1表達量顯著高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，利魯唑和針刺組均能降低SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1表達水平，且利魯唑組與針刺組對各檢測指標的影響均無顯著性差異(P>0.05)。結論針刺對谷氨酸釋放有明顯的調節作用，可溶性NSF附著蛋白受體(SNARE)介導的突觸前谷氨酸釋放在抑郁癥的發病以及針刺抗抑郁過程中有重要作用，可能是針刺抗抑郁的靶點之一。

〔關鍵詞〕針刺；抑郁癥；海馬；SNARE蛋白；谷氨酸

抑郁癥又稱抑郁障礙，病因復雜、臨床癥狀多樣。谷氨酸引起的興奮毒性是中樞神經系統疾病的共同分子機制。藥物治療和心理治療是目前抑郁癥治療的主要手段，比較常用的抗抑郁藥有單胺氧化酶抑制劑(MAOI)和三環類抗抑郁藥(TCA)，均為中樞神經類藥物。利魯唑作為谷氨酸釋放抑制劑具有明確的神經保護作用，可抑制多種受體和離子通道介導的谷氨酸突觸傳導和神經元超興奮性，保護神經元免受興奮毒性損傷〔1～3〕。本文通過不可預測的溫和性刺激建立抑郁癥大鼠模型，給予利魯唑灌胃和針刺后，觀察模型鼠的行為學改變、海馬組織谷氨酸含量、谷氨酸釋放相關的可溶性NSF附著蛋白受體(SNARE)表達水平的變化，探討針刺抗抑郁的可能分子機制及其作用靶點。

1材料與方法

1.1實驗動物選用體重180～220 g的成年SD雄性大鼠32只，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2主要試劑與儀器利魯唑片(法國安萬特制藥公司)；Trizol、逆轉錄試劑盒(美國invitrogen公司)；抗突觸小泡膜相關蛋白(VAMP)1、抗VAMP2、抗VAMP7、抗突觸小體相關蛋白(SNAP)-25和anti-syntaxin1(美國Abcam公司)；熒光定量檢測試劑盒(廣州市達暉生物技術有限公司)。

Leica5001石蠟切片機 (德國萊卡)；Image-Pro PlusM IS2000圖像分析系統 (美國Media Cybernetics公司)；G6805-Ⅱ型電針治療儀(上海醫用電子儀器廠)；XSP-2C 光學顯微鏡(上海光學儀器廠)；HC-3018R高速冷凍離心機(安徽科大創新股份有限公司)；ABI 9700 PCR儀(美國ABI 公司)。

1.3造模方法采用長期不可預見性溫和刺激模型，共接受21 d各種不同的應激，包括冰水游泳5 min、禁水24 h、禁食24 h、夾尾1 min、搖晃(1次/s，15 min)、晝夜顛倒、電擊足底(5 min/次)等刺激，每天隨機安排1種，平均每種刺激各進行21次，使動物不能預料刺激的發生。

1.4實驗分組成年雄性SD大鼠32只隨機分為空白組、模型組、針刺組(合谷+太沖)和利魯唑組，每組8只。空白組進行正常飼養，不給予任何處理；模型組在造模后不給予其他處理；利魯唑組造模成功后，每天給予利魯唑灌胃(1.8 mg/kg，溶解于生理鹽水中)1次，持續21 d；針刺組造模后同時電針刺合谷和太沖穴(G6805Ⅱ型電針治療儀，疏密波，2～20 Hz，強度以肉眼可見大鼠肢體輕微顫動為度)，1次/d，每次15 min，左右兩側穴位交替進行，持續21 d。

1.5行為學觀察在治療前及治療后第7、14、22天，用曠場試驗觀察各組大鼠行為(水平運動和垂直運動 )的變化。以動物穿越底面的塊數為水平活動的得分數，以直立次數為垂直活動的得分數，每只動物共進行4次測定，每次3 min。在應激第22天，觀察大鼠體重和24 h蔗糖溶液消耗量(即24 h飲用1% 蔗糖溶液量)的變化。

1.6海馬組織谷氨酸含量測定大鼠腹腔注射麻醉后處死，迅速分離出海馬組織，稱重，-80℃ 冰箱保存。待測海馬組織置勻漿器中，加適量90%乙醇冷凍環境下進行勻漿，取上清液在 80℃水浴中蒸干除去乙醇，經0.45 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定谷氨酸含量。色譜條件：Hypersil ODS 色譜柱，4.0×125 mm，粒徑5 μm；柱溫40℃；流動相(A)：10 mmol/L Na2HPO4pH值7.2緩沖液(PB)；流動相(B)：PB+甲醇+乙腈(50+35+15)；線性梯度：0～25 min，流動相 B以線性從0%上升到100%。流量：1.0 ml/min。檢測波長：激發波長340 nm，發射波長450 nm。

1.7Western印跡檢測SNAP-25、VMAP1、VMAP2、VMAP7和syntaxin1蛋白水平利用組織裂解液裂解腦組織，然后進行組織蛋白定量；取25 μg蛋白加入上樣緩沖液，沸水浴5 min后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至PVDF膜；電轉結束后，TBS溶液(含5%脫脂奶粉)4℃封閉過夜；封閉結束后，將聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉移至含目的抗體的Tris鹽酸緩沖液(TBS)，室溫2 h；1×TBS洗膜5 min×5次；加入二抗溶液，室溫孵育1 h；1×TBS洗膜5 min×5次；增強化學發光法(ECL)試劑盒曝光并顯影。掃描顯影條帶，采用Phoretix 2D軟件進行灰度值分析，以同一樣品的SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1與GAPDH條帶的灰度值比值作為SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1蛋白的相對含量。

1.8熒光定量PCR檢測SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1 mRNA含量采用RNA提取試劑盒提取海馬組織總RNA，經紫外分光光度計測定濃度及純度。參照定量PCR試劑盒操作說明，上述準備的RNA為模板進行反轉錄獲取cDNA。采用2倍SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為模板，20 μl反應體系進行擴增，每個待測樣本設置3個平行，分別檢測SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1基因，并以18S基因為內參照，三次獨立實驗后得到的數據運用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進行分析。引物(上海生工生物合成)序列：SNAP-25正義-5′-GCAGGTGAGCGGCATCAT-3′，反義-5′-GCACGTTGGTTGGCTTCATC-3′；VAMP1正義-5′-GCGTCCCACATGCTTCTGACT-3′，反義-5′-GCGTGTTCCTGAGAGCCTGTT-3′；VAMP2正義-5′-GGTGGATGAGGTGGTGGACAT-3′，反義-5′-CGCTTGAGCTTGGCTGCACTT-3′；VAMP7正義-5′-GCCCAAGTGGACGAACTGAAAGG-3′，反義-5′-GGTGACGGACGAATCTACGAGGT-3′；syntaxin1正義-5′-GTGGAACACGCTGTGGACTAC-3′,反義-5′-CGATGGTGGAGGCGATGATGAT-3′;18S正義-5′-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCAT-3′,反義-5′-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3′。

1.9統計學方法應用SPSS19.0軟件行LSD法檢驗。

2結果

2.1行為學觀察結果經過21 d不可預測的溫和性刺激，大鼠表現出抑郁癥的行為學改變，包括運動量、體重和蔗糖消耗量均顯著下降。曠場試驗結果顯示，模型組大鼠的水平運動和垂直運動量均顯著下降。隨著利魯唑或針刺治療的進行，抑郁癥大鼠的運動量逐漸增多；體重和蔗糖消耗量也有不同程度的恢復(P<0.05)。見表1，表2。

表1　曠場試驗結果

表2　大鼠體重和蔗糖溶液消耗量的變化±s,n=8)

2.2海馬組織谷氨酸含量測定結果經過21 d不可預測的溫和性刺激，海馬組織谷氨酸含量從空白組的(1.07±0.30)mg/g升高到模型組的(1.61±0.42)mg/g(P<0.05)。當給予利魯唑治療或針刺處理后，其谷氨酸含量發生顯著性下降(P<0.05)，分別下降到(1.15±0.36)mg/g和(1.23±0.31)mg/g。

2.3Western印跡檢測SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1蛋白水平與空白組相比，模型組SNAP-25蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，利魯唑組和針刺組的SNAP-25蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。其余四種蛋白的相對表達水平具有上述相似的變化趨勢。見圖1。

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下圖同圖1　各組大鼠谷氨酸循環相關蛋白的表達變化

2.4RT-PCR檢測SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP7和syntaxin1 mRNA含量與空白組比較，模型組SNAP-25表達水平顯著升高(P<0.05)；當模型組大鼠給予利魯唑或者針刺治療后，SNAP-25表達水平顯著下降，接近空白組的正常大鼠(P<0.05)。其余四種基因的表達趨勢與SNAP-25基因表達趨勢相似。見圖2。

圖2　各組大鼠谷氨酸循環相關基因的表達變化

3討論

神經遞質釋放過程是神經系統信息傳遞的基本過程，是生命活動的基本事件之一，而突觸囊泡胞吐過程又是神經遞質釋放機制中的一個核心問題。SNARE 核心復合物是突觸囊泡胞吐過程中的核心成分，而且參與幾乎所有分泌細胞的胞吐過程，其由三種蛋白質組成：VAMP，突觸前膜上的蛋白syntaxin和SNAP-25〔4〕，受到不可預見的溫和性刺激后，VAMP蛋白、syntaxin蛋白和SNAP-25均發生顯著上調〔5〕。相反地，破傷風毒素和肉毒神經毒素可通過選擇性酶解不同SNARE 蛋白而抑制神經遞質的釋放〔6〕，證明了SNARE 蛋白在神經遞質釋放中的重要作用。

對抑郁癥病因病理學的傳統解釋主要集中于中樞神經單胺類遞質的功能失調上，然而，新的研究表明，除單胺神經遞質外，谷氨酸等也扮演了重要的角色〔7〕。谷氨酸作為一種中樞神經遞質，存在于海馬，尾狀核、下丘腦和小腦中。在前腦中，使用興奮性氨基酸的神經元占總神經元的30%以上，皮質中也含有高密度的接受谷氨酸作用的神經元。在臨床研究中發現抑郁癥患者的谷氨酸含量和活性顯著升高〔7〕。Reagan〔8〕研究發現，大鼠給予不可預見的溫和性刺激處理后，谷氨酸含量顯著升高，海馬組織結構發生變化。Ongur等〔9〕的“興奮性氨基酸學說”指出抑郁癥的病因學與谷氨酸介導的神經系統功能紊亂有關。

本實驗采用不可預見的溫和性刺激建立抑郁癥模型，應激后大鼠呈明顯的活動能力、體重和蔗糖消耗量下降，抑郁癥動物模型建立成功。在調節谷氨酸釋放方面，針刺和抗抑郁藥物的療效相當。對SNARE相關基因和蛋白的檢測發現，SNARE蛋白作為谷氨酸釋放的介質，針刺和抗抑郁藥物均能引起其含量的變化。基于上述結果，本文認為SNARE蛋白介導的突觸前谷氨酸釋放在抑郁癥的發病以及針刺抗抑郁過程中有重要作用，可能是針刺抗抑郁的靶點之一。

4參考文獻

1胡永波.抑郁模型大鼠海馬突觸蛋白質組學初步研究〔D〕.重慶：重慶醫科大學，2011.

2Sanacora G，Kendell SF，Levin Y，etal.Preliminary evidence of riluzole efficacy in antidepressant-treated patients with residual depressive symptoms 〔J〕.Biol Psychiatry，2007；61(6)：822-5.

3鐘寶亮，黃悅勤，李會娟.針灸治療抑郁癥療效和安全性的系統評價〔J〕.中國心理衛生，2008；22(9)：641-7.

4梁麗娟，黃薇.SNARE蛋白及其復合物在突觸融合過程中的作用〔J〕.天津藥學，2012；24(6)：62-5.

5Musazzi L，Milanese M，Farisello P，etal.Acute stress increases depolarization-evoked glutamate release in the rat prefrontal/frontal cortex：the dampening action of antidepressants 〔J〕.PLoS One，2010；5(1)：8566.

6Somm E,Bonnet N,Martinez A，etal.A botulinum toxin-derived targeted secretion inhibitor downregulates the GH/IGF1 axis 〔J〕.J Clin Invest，2012；122(9)：3295-306.

7Croarkin PE，Nakonezny PA，Husain MM，etal.Evidence for increased glutamatergic cortical facilitation in children and adolescents with major depressive disorder 〔J〕.JAMA Psychiatry，2013；70(3)：291-9.

8Reagan LP，Reznikov LR，Evans AN，etal.The antidepressant agomelatine inhibits stress-mediated changes in amino acid efflux in the rat hippocampus and amygdala 〔J〕.Brain Res，2012；1466(5)：91-8.

9Ongur D，Drevets WC，Price JL.Glial reduction in the subgenual prefrontal cortex in mood disorders 〔J〕.Proc Natl Acad Sci，1998；95(22)：13290-5.

〔2015-12-19修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目(No.81303041)；中國博士后科學基金面上項目(No.2012M511784)；廣東省教育廳高校優秀青年創新人才培養計劃項目(No.2012LYM_0043)；國家教育部高等學校博士學科點新教師類專項科研基金(No.20124425120005)；中國博士后基金特別資助項目(No.2013T60793)；廣東省人社廳資助廣州中醫藥大學博士后研究人員科研基金(No.BBK429122K19)

通訊作者：符文彬(1963-)，男，博士，主任醫師，教授，博士生導師，博士后合作教授，主要從事針灸治療疼痛及抑郁相關病癥的研究。

〔中圖分類號〕R2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3123-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.013

Effect of acupuncture on the release of presynaptic glutamate mediated by SNARE protein in hippocampus of rats with depression

FAN Ling, ZAHO Qian-Qi,Lü Ai-Ping,et al.

Department of Acupuncture and Moxibustion, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of acupuncture on depression and its related possible therapeutic target.MethodsDepressive disorder model was induced by exposure to chronic unpredictable stress using Sprague Dawley rats. Acupuncture stimulation and riluzole were used to treat the depressed rats. Behavior changes, hippocampucal glutamate content and glutamate-glutamine cycle related genes SNARE, were analyzed before and after therapy.ResultsCompared with the blank group, the rats showed horizontal or vertical movements, weight and sucrose consumption significantly decreased (P < 0.05), and the glutamate content in hippocampus was increased (P<0.05). After riluzole and acupuncture treatment, horizontal or vertical movements, weight and sucrose consumption were significantly increased (P<0.05), and the glutamate content in hippocampus was decreased. Western blot and RT-PCR showed that the expression of SNAP-25, VMAP7, VMAP1, VMAP2 and syntaxin1 in the model group were significantly higher than those of the blank group (P<0.05). Compared with the model group, riluzole and acupuncture could reduce the expression levels of SNAP-25, VMAP1, VMAP7, VMAP2 and syntaxin1，and there were no significant differences between the acupuncture and riluzole group(P>0.05).ConclusionsAcupuncture has a significant regulatory effect on glutamate release, SNARE protein mediated presynaptic release of glutamate plays an important role in depression, and it may be one of the targets of antidepression.

【Key words】Acupuncture; Depression; Hippocampus; SNARE protein; Glutamate

1香港浸會大學中醫藥學院2廣州中醫藥大學

3中國循證醫學中心4廣東省中醫藥科學院

第一作者：樊凌(1982-)，女，博士，中西醫結合博士后，副主任醫師，碩士生導師，主要從事針灸治療疼痛及抑郁相關病癥的研究。