針灸預處理對成年和老年甲醛致痛大鼠脊髓NO分布和c-fos表達的影響

宋亞光　魏子淳　王　宇　徐熙萌　饒晨旭　譚會兵　霍博雅

(錦州醫科大學，遼寧　錦州　121001)

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針灸預處理對成年和老年甲醛致痛大鼠脊髓NO分布和c-fos表達的影響

宋亞光魏子淳王宇徐熙萌饒晨旭譚會兵霍博雅1

(錦州醫科大學，遼寧錦州121001)

〔摘要〕目的比較成年和老年大鼠對炎癥性疼痛反應的差別，以及針灸預處理對成年和老年甲醛致痛大鼠脊髓一氧化氮(NO)分布和c-fos表達的影響。方法將4月齡和21月齡雄性SD大鼠分別隨機分為對照組(不做任何處理)、甲醛組(僅注射甲醛)、針灸足三里穴+甲醛組(針灸足三里穴后注射甲醛)、針灸非穴位+甲醛組(針灸非穴位后注射甲醛)，每組6只大鼠。針灸處理后，除對照組外，其余各組于針灸位點同側足底注射甲醛。觀察大鼠行為學反應，記錄甲醛注射后1 h內的縮足次數和舔(咬)足時間，1.5 h后灌流取脊髓第4腰髓至第5腰髓節段，采用酶組織化學染色和免疫組織化學染色法檢測脊髓NO的分布和c-fos的表達。結果對照組NO數量較低，且老年大鼠脊髓背角NO數量低于成年大鼠(P<0.01)；Fos免疫陽性神經元基礎水平較低，且在成年和老年大鼠間無差異(P>0.05)；成年和老年大鼠脊髓未發現NO和Fos雙標陽性神經元。甲醛組老年大鼠繼發疼痛時相的縮足次數高于成年大鼠(P<0.05)；與對照組比較，NO陽性神經元、Fos免疫陽性神經元和二者雙標陽性神經元數量在成年和老年大鼠脊髓均增加(P<0.01)，且老年大鼠的NO陽性神經元(脊髓背角，P<0.05；中央管，P<0.01)和Fos免疫陽性神經元數量(P<0.01)高于成年大鼠。針灸足三里穴+甲醛組成年和老年大鼠繼發疼痛時相的縮足次數(P<0.01)和舔(咬)足時間(成年，P<0.05；老年，P<0.01)低于甲醛組；成年和老年大鼠脊髓NO陽性神經元、Fos免疫陽性神經元和二者雙標陽性神經元數量均低于甲醛組(P<0.01)；且老年組NO陽性神經元和Fos免疫陽性神經元數量較甲醛組下降的幅度高于成年組大鼠(P<0.01)。針灸非穴位+甲醛組成年和老年大鼠繼發疼痛時相的縮足次數、舔(咬)足時間、NO陽性神經元、Fos免疫陽性神經元和二者雙標陽性神經元數量與甲醛組比較無差異(P>0.05)。結論老年大鼠對炎癥性疼痛的反應強于成年大鼠，針灸預處理足三里穴可以提高大鼠痛閾，減輕疼痛反應，降低脊髓NO的數量和c-fos的表達，且對老年大鼠的作用優于成年大鼠。

〔關鍵詞〕針灸預處理；衰老；一氧化氮(NO)；c-fos

研究報道，針灸足三里可有效抑制甲醛誘導的疼痛效應，且鎮痛作用顯著〔1〕。這種效應可能與脊髓疼痛相關基因的轉錄被抑制有關，例如即早基因c-fos〔2〕。當有害信號傳入脊髓，原癌基因c-fos及其蛋白產物Fos迅速表達并持續較短時間。作為對皮膚傳入有害刺激的應答，c-fos在脊髓神經元的表達已經被作為反映疼痛強度的指示器。一氧化氮(NO)可作為第二信使誘導c-fos表達，通過外周機制調節脊髓傷害性刺激，抑制NO的生成，具有顯著的抗疼痛作用。一氧化氮合酶(NOS)是生成NO的關鍵酶。神經系統中的還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脫氫酶(NADPH)和NOS是同一種酶，目前多采用還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸還原酶(NADPH-d)組織化學染色標記NOS來確定NO在神經元的分布。研究發現，足底甲醛注射可引起脊髓背角NADPH-d陽性神經元數量增加和Fos免疫陽性神經元大量表達〔3〕。針灸預處理能夠啟動機體自身的防御機制，抵御未發生但可能發生的疾病或損傷〔4～7〕。針灸預處理足三里穴可有效抑制c-fos在甲醛注射大鼠脊髓第4腰髓(L4)至第5腰髓(L5)節段的表達〔8〕，c-fos的表達水平可以作為評估超前鎮痛效果的指標。本實驗選取足三里穴進行針灸預處理，采用足底甲醛致痛模型，觀察成年和老年大鼠對炎癥性疼痛反應的差別及針灸預處理對成年和老年大鼠脊髓NO分布和c-fos表達的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物和分組4月齡〔n=24，體重(350±50)g〕和21月齡〔n=24，體重(500±50)g〕雄性SD大鼠分別隨機分為四組：4月齡對照組(CTL-1，不做任何處理)，4月齡甲醛組(For-1，僅注射甲醛)，4月齡針灸足三里穴+甲醛組(ST36+For-1，針灸足三里穴后注射甲醛)，4月齡針灸非穴位+甲醛組(NA+For-1，針灸非穴位后注射甲醛)；21月齡對照組(CTL-2)，21月齡甲醛組(For-2)，21月齡針灸足三里穴+甲醛組(ST36+For-2)和21月齡針灸非穴位+甲醛組(NA+For-2)，每組6只。所有動物均購自遼寧醫學院動物管理基地，動物實驗得到遼寧醫學院動物管理委員會的許可。

1.2實驗方法

1.2.1針灸操作采用一次性無菌針灸針進行針灸操作。足三里穴定位在脛骨和腓骨之間，約脛骨前嵴外5 mm和下5 mm的交界處〔9〕。髂嵴上10～15 mm、后正中線旁開20 mm區段內確定一固定對照點作為非穴位點〔10〕。在乙醚吸入麻醉下，分別針灸右側足三里穴及非穴位點。對照組和甲醛注射組與其他針灸組做相同時間吸入麻醉的處理，以確保相同的實驗條件。針灸針刺入穴位后，每秒鐘按順、逆時針方向捻轉針體2次，如此行針1 min、留針9 min為1個周期，重復4個周期，共計40 min〔11〕。最后9 min，停止吸入麻醉使大鼠蘇醒，針灸針的插入深度約為4～5 mm。針灸預處理每日一次，連續7 d。

1.2.2甲醛注射和行為學觀察最后一次針灸預處理后，待動物完全蘇醒，除了對照組，其余各組動物均在右后足底皮下注射100 μl 5%的甲醛，對照組不做任何處理。甲醛注射后，將大鼠置于透明玻璃罩中，通過視頻捕捉系統記錄注射甲醛溶液后1 h內大鼠注射足的回縮次數和舔(咬)足時間(s)，每5 min統計一次，用來評估大鼠疼痛的程度。

1.2.3灌流取材甲醛注射1.5 h后，在10%水合氯醛深麻下灌流固定(0.4 ml/100 g，腹腔注射)，取出脊髓L4～L5節段，于4%多聚甲醛溶液中后固定。冰凍切片40 μm，將切片分為三部分，分別進行NADPH-d組織化學染色、c-fos免疫組織化學染色和NADPH-d/Fos雙標染色。

1.2.4NADPH-d組織化學法染色切片于含0.2% TritonX-100的Tris緩沖液中室溫下孵育5～10 min，然后在含有0.3% TritonX-100、1 mg/ml NADPH和0.5 mg/ml NBT的Tris緩沖液中，37℃ 孵育1～1.5 h。Tris緩沖液漂洗終止反應。

1.2.5c-fos免疫組織化學染色將各組切片置于溶于甲醇溶液的0.3%過氧化氫溶液中處理30 min，以消耗內源性的過氧化物酶。2%的正常山羊血清溶液中室溫封閉2 h后置于兔多克隆抗c-fos抗體(1∶8 000，Abcam)中室溫孵育48 h(加入0.1%的疊氮鈉)。于生物素化山羊抗兔IgG溶液(1∶1 000，Vector Lab)中室溫孵育2 h后，在鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶溶液(1∶1 000，Vector Lab)中室溫孵育1.5 h。最后，在含0.02%二氨基聯苯胺(DAB)和0.004%過氧化氫的0.05 mol/L的Tris緩沖液(pH 7.4)中室溫顯色15 min。Tris緩沖液漂洗終止反應。

1.2.6NADPH-d/Fos雙標染色切片進行NADPH-d組織化學染色后再進行c-fos免疫組織化學染色(方法同上)。終止反應后將切片裱在明膠包被的載玻片上，干燥，脫水，透明，封片。

2結果

2.1行為學檢測甲醛注射后，大鼠呈典型的雙向傷害性行為反應，即注射后即刻出現約5 min的急性疼痛時相，后5 min減弱；約從10～60 min內出現繼發性疼痛。①急性疼痛時相(0～10 min)：4月齡和21月齡大鼠的縮足次數和舔(咬)足時間在甲醛組、針灸足三里穴+甲醛組、針灸非穴位+甲醛組之間沒有統計學差異(P>0.05)。②繼發性疼痛時相(10～60 min)：甲醛組21月齡大鼠的縮足次數高于4月齡大鼠(P<0.05)，舔(咬)足時間與4月齡比較無差異(P>0.05，圖1B)；針灸足三里穴+甲醛組4月齡大鼠的縮足次數(P<0.01)和舔(咬)足時間(P<0.05)低于甲醛組，21月齡大鼠的縮足次數和舔(咬)足時間低于甲醛組(P<0.01)；4月齡和21月齡大鼠針灸非穴位+甲醛組與甲醛組之間比較無統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.2NADPH-d組織化學法染色NADPH-d陽性神經元呈藍色深染，主要分布在甲醛注射側脊髓背角(DH，圖2A)和中央管(CC，圖2B)附近。結果顯示，對照組中，NADPH-d陽性神經元的基礎水平較低，且21月齡大鼠DH的NADPH-d陽性神經元數量低于4月齡大鼠(P<0.01)。與對照組比較，其他各組大鼠DH(P<0.01)和CC(P<0.01)附近的NADPH-d陽性神經元數量均高于對照組。甲醛組中，21月齡大鼠NADPH-d陽性神經元數量高于4月齡大鼠(P<0.05，P<0.01)。與甲醛組比較，4月齡和21月齡大鼠針灸足三里穴+甲醛組DH的NADPH-d陽性神經元數量均下降(P<0.01)，而脊髓CC附近的NADPH-d陽性神經元數量無變化(P>0.05)。4月齡和21月齡大鼠針灸非穴位+甲醛組的NADPH-d陽性神經元數量與甲醛組比較無差異(P>0.05)。見表2。

表1　各組行為學檢測結果統計表±s,n=6)

與For-1組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與For-2組比較:3)P<0.01

表2　各組陽性神經元數

與CTL-1組比較：1)P<0.01；與CTL-2組比較：2)P<0.01；與For-1組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與For-2組比較：5)P<0.01

A′、B′分別為A、B中方塊內的放大圖片；下圖同圖2　NADPH-d組織化學法染色結果

2.3Fos免疫組織化學法染色對照組中，Fos免疫陽性神經元的基礎水平較低，且在4月齡和21月齡大鼠脊髓中沒有統計學差異(P>0.05)。與對照組大鼠比較，其他各組大鼠脊髓Fos免疫陽性神經元的表達均增加(P<0.01)。甲醛組中，21月齡大鼠的Fos免疫陽性神經元數高于4月齡大鼠(P<0.01)。與甲醛組比較，4月齡和21月齡大鼠針灸足三里穴+甲醛組的Fos免疫陽性神經元數均下降(P<0.01)，而針灸非穴位+甲醛組Fos免疫陽性神經元無變化(P>0.05)。見圖3，表2。

圖3　Fos免疫組織化學法染色結果

2.4NADPH-d/Fos雙標染色4月齡和21月齡大鼠對照組均未發現NADPH-d/Fos雙標的陽性神經元，其余各組均在DH發現NADPH-d/Fos雙標的陽性神經元，而在脊髓CC附近沒有。甲醛組中，4月齡和21月齡大鼠脊髓NADPH-d/Fos雙標陽性神經元數量無差異(P>0.05)。與甲醛組比較，4月齡和21月齡大鼠針灸足三里穴+甲醛組的NADPH-d/Fos雙標陽性神經元數量均下降(P<0.01)。4月齡和21月齡大鼠針灸非穴位+甲醛組的NADPH-d/Fos雙標陽性神經元數量與甲醛組比較無差異(P>0.05)。見圖4，表2。

圖4　NADPH-d/Fos雙標染色結果

2.5甲醛組與針灸足三里穴+甲醛組的差值分別統計4月齡和21月齡大鼠甲醛組(For組)與針灸足三里穴+甲醛組(ST36+For組)的NADPH-d陽性神經元、Fos免疫陽性神經元和NADPH-d/Fos雙標陽性神經元數量的差值，結果顯示，21月齡大鼠的NADPH-d陽性神經元(10.05±1.59)、Fos免疫陽性神經元數量(50.47±2.67)在For組和ST36+For組之間的差值均高于4月齡大鼠(4.85±1.15,29.97±1.85)(P<0.01)，而NADPH-d/Fos雙標陽性神經元數量的差值在4月齡(2.18±0.55)和21月齡(1.07±0.30)大鼠間無差異(P>0.05)。

3討論

足三里穴的軀體傳入神經投射到脊髓L4～L5節段〔12〕。足底甲醛注射后，大鼠呈典型的雙向傷害性行為反應，急性疼痛反應是由于外周的直接刺激引起，而繼發性疼痛反應則涉及中樞神經系統的參與。本實驗顯示，繼發性疼痛時相甲醛組老年大鼠的縮足次數高于成年大鼠，表明老年大鼠對炎癥性疼痛的反應較成年大鼠更敏感。針灸預處理足三里穴減少了大鼠繼發性疼痛時相注射足的縮足次數和舔(咬)足時間，這說明針灸預處理足三里穴減輕了大鼠的疼痛反應，提高了疼痛閾值。

NO作為重要的神經調節因子，其產生異常影響著衰老的進程〔13〕。適量NO具有明顯的神經保護作用，但過量的NO則會對神經元產生毒性。正常成年脊髓存在NOS能神經元，NO參與脊髓疼痛信號的傳遞，抑制NO的生成具有顯著的抗疼痛作用。本研究證實，老年大鼠脊髓NO的基礎水平低于成年大鼠，這與衰老后機體的免疫力下降、功能減退相符。足底甲醛刺激后，DH和CC附近NO的數量增加，且在老年大鼠的含量高于成年大鼠。DH和CC附近是感受疼痛的主要區域，針灸預處理足三里穴后，DH的NO含量下降，且老年大鼠的下降幅度高于成年大鼠，這可能與足三里穴的軀體傳入神經纖維上行投射至脊髓L4～L5節段背角有關。以上結果表明，衰老大鼠對疼痛反應更為敏感，且針灸處理對衰老大鼠的鎮痛作用強于成年大鼠。NO可作為第二信使誘導c-fos表達，NO通過激活c-fos的表達影響感受疼痛神經元的中樞敏化作用，釋放其他的多肽和氨基酸，從而調控神經元活性。c-fos表達作為軀體和內臟傷害性刺激引起中樞神經系統神經元激活的標志，被認為是神經系統功能的一種特殊標記〔14〕。近年研究報道，疼痛信號隨年齡的變化而改變。與青年和成年大鼠比較，c-fos在新生大鼠DH淺層、深層和腹角的表達顯著增加〔15〕。在甲醛注射后的中老年大鼠腦中Fos 免疫陽性神經元表達的數量顯著高于青年大鼠〔16〕。在某些方面，中年小鼠對內毒素暴露比年輕小鼠更為敏感，且在大腦中顯現出增強的c-fos表達〔17〕，c-fos mRNA的轉錄在老年大鼠背側海馬的椎體細胞和顆粒細胞中發生改變〔18〕。然而，關于疼痛信號在老年脊髓的變化及針灸預處理在老年領域的研究還很匱乏。本實驗結果證實，正常情況下脊髓c-fos表達的基礎水平較低，足底甲醛刺激后，大量Fos蛋白在脊髓L4～L5節段DH淺層表達，且在老年大鼠的表達高于成年大鼠。針灸預處理足三里穴降低了c-fos在脊髓的表達，且老年大鼠的下降幅度高于成年大鼠，這與NO數量變化結果一致。此外，本實驗發現，在對照組中沒有NADPH-d/Fos雙標陽性神經元；甲醛注射后，NADPH-d/Fos雙標陽性神經元在DH出現，CC附近沒有，且在老年大鼠與成年大鼠間無差異。針灸預處理足三里穴降低了DH的NADPH-d/Fos雙標陽性神經元數量。

綜上研究結果，老年大鼠對炎癥性疼痛的反應強于成年大鼠。針灸預處理足三里穴可以減輕大鼠疼痛反應，降低脊髓NO的數量和c-fos的表達，具有超前鎮痛的效果。然而，針灸預處理足三里穴后，老年大鼠脊髓NO和Fos蛋白下降的數量高于成年大鼠，但是NADPH-d/Fos雙標陽性神經元下降的數量在老年大鼠和成年大鼠間無差異。由此我們推測，針灸預處理的鎮痛作用在成年和老年大鼠之間可能涉及不同信號通路的參與，這將為衰老相關機制的研究提供新的線索。

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〔2015-12-07修回〕

(編輯李相軍)

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81471286)

通訊作者：譚會兵(1963-)，男，教授，碩士生導師，主要從事老年腰骶脊髓研究。

〔中圖分類號〕R2-031

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3101-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.005

Effects of acupuncture preconditioning on NO distribution and c-fos expression in spinal cord of adult and aged rats with formalin-induced pain

SONG Ya-Guang, WEI Zi-Chun, WANG Yu,et al.

Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning, China

【Abstract】ObjectiveTo compare the difference of the response to inflammatory pain of adult and aged rats, and the effects of acupuncture preconditioning (AP) on nitric oxide (NO) distribution and c-fos expression in the spinal cord of adult and aged rats with formalin injection.MethodsThe 4 and 21 months old male SD rats were randomly divided into control (CTL, with nothing treated), formalin-injection-only group (For), formalin injection following AP at the acupoint ST36 group (ST36+For) and formalin injection following AP at a non-acupoint groups (NA+For) respectively. The behavioral responses of rats were observed, and the flinching number and licking time in 1 hour after formalin injection were recorded. The segment of 4th lumbar spinal cord to 5th lumbar spinal cord was obtained 1.5 hours after formalin injected. The distribution of NO and the Fos-immunoreactive (Fos-ir) neurons were detected by enzyme histochemical and immunohistochemical techniques.ResultsIn control group, the number of NO of aged rats was lower than that of adult rats(P<0.01); there were no double labeled neurons of NO and Fos in adult and aged rats. In formalin-injection-only groups: the flinching number in the late phase was higher in aged rats than that in adult ones (P<0.05). Compared to those of control groups, the number of NO positive neuron was increased, Fos positive neurons and double labeled neurons of NO and Fos were observed in the spinal cord of both adult and aged rats (P<0.01). The number of NO positive neuron (P<0.05, P<0.01) and Fos positive neurons (P<0.01) were higher in aged rats than those in adult ones. In formalin injection following AP at the acupoint ST36 groups, the flinching number (P<0.01) and licking time (P<0.05,P<0.01) in the late phase of adult and aged rats were lower than those of formalin-injection-only groups. The number of NO positive neuron, Fos positive neuron and double labeled neuron of NO and Fos in adult and aged rats were both lower than those of formalin-injection-only groups(P<0.01). Compared to those of formalin-injection-only groups, the range of decline of the number of NO positive neuron and Fos positive neuron were higher in aged rats than those in adult ones(P<0.01). ConclusionsAP at the acupoint ST36 could improve the pain threshold, relieve the pain reaction, and reduce the number of NO and the expression of c-fos in spinal cord which with more potential in aged rats.

【Key words】Acupuncture preconditioning; Aging;Nitric oxide(NO);c-fos

1錦州醫科大學附屬第三醫院

霍博雅(1960-)，女，教授，碩士生導師，主要從事中西醫結合抗衰老的研究。

第一作者：宋亞光(1991-)，女，碩士，主要從事中西醫結合抗衰老研究。