自愿轉輪運動對慢性應激大鼠下丘腦乙酰膽堿代謝及室旁核c-fos表達的影響

崔建梅　郭旭玥　于　芳　藥宏慧　蘇曉云　龐立杰　趙行瑞

(中北大學體育學院，山西　太原　030051)

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自愿轉輪運動對慢性應激大鼠下丘腦乙酰膽堿代謝及室旁核c-fos表達的影響

崔建梅郭旭玥于芳藥宏慧1蘇曉云2龐立杰3趙行瑞

(中北大學體育學院，山西太原030051)

〔摘要〕目的探討4 w自愿轉輪運動對慢性不可預知應激致抑郁大鼠下丘腦乙酰膽堿代謝及下丘腦室旁核c-fos表達的影響。方法隨機將30只大鼠分為對照組(C，n=10)、應激模型組(SM，n=10)及運動應激組(SEX，n=10)。SEX及SM組大鼠每日進行慢性不可預知性應激1次，連續28 d，SEX組大鼠同時進行4 w自愿轉輪運動。慢性應激及轉輪運動結束后檢測大鼠下丘腦乙酰膽堿酯酶(AchE)及膽堿乙?；D移酶ChAT的活性，采用免疫組織化學結合圖像半定量方法對下丘腦室旁核 c-fos 神經元的數量、面積及灰度進行測量和分析。結果與C組比較，慢性應激大鼠下丘腦AchE及ChAT活性均顯著增強(P<0.01，P<0.01)，下丘腦室旁核c-fos表達顯著增加(P<0.01)；經過4 w自愿轉輪運動，與SM組大鼠比較，SEX大鼠下丘腦AchE及ChAT活性顯著減弱(P<0.05，P<0.05)，下丘腦室旁核c-fos表達降低(P<0.05)。結論長期自愿轉輪運動可以糾正慢性應激致抑郁模型大鼠下丘腦膽堿能系統功能亢進并減弱下丘腦室旁核 c-fos 的表達。

〔關鍵詞〕自愿轉輪運動；抑郁大鼠；下丘腦；乙酰膽堿系統；c-fos

抑郁癥是一種使人衰弱的、常見的、危及生命的精神障礙性疾病，臨床表現為持續性情緒低落、思維遲鈍、言語動作減少，嚴重者伴有自殺行為〔1〕，慢性應激已成為誘發抑郁的重要因素〔2〕。Drevets等〔3〕認為中樞膽堿能系統在抑郁癥的發病過程中起重要作用。乙酰膽堿激動劑及膽堿酯酶抑制劑可引起抑郁患者嚴重的抑郁情緒、煩躁不安和焦慮行為〔4〕。Dong等〔5〕認為，急性應激可以增加大腦乙酰膽堿(Ach)的釋放，而慢性應激對大腦Ach的影響還不清楚。在中樞神經系統中，與應激刺激密切相關的腦區主要有海馬、前額葉皮層、紋狀體、杏仁核下丘腦等核團，HPA 軸(下丘腦-垂體-腎上腺軸)是機體應激反應的主要調節系統，被認為是許多抑郁癥癥狀和體征產生的“最后共同通路”，其結構基礎為下丘腦室旁核(PVN)和腎上腺皮質。下丘腦PVN與邊緣結構聯系緊密，在控制應激行為反應中發揮了重要的作用，被認為是應激反應的中樞驅動力〔6〕。當機體遭受損害性刺激時fos蛋白表達增多〔7〕，但在慢性應激時fos蛋白表達尚無定論。因此，本實驗通過制備慢性不可預知的溫和應激(CUMS)抑郁模型，探討4 w自愿轉輪運動對抑郁模型大鼠下丘腦膽堿乙酰轉移酶(ChAT)及乙酰膽堿酯酶(AchE)活性和下丘腦室旁核c-fos表達的影響。

1材料與方法

1.1動物及分組30只3月齡健康成年雄性SD大鼠，體重200～220 g，控制室溫為(22±1)℃，濕度(55～65)%，自由攝食與飲水，12 h明暗交替(光照8∶00～20∶00)，大鼠適應實驗室環境1 w后正式進行實驗。30只大鼠被隨機分為應激模型組(SM，n=10)、運動應激組(SEX，n=10)及對照組(C，n=10)。應激組大鼠單獨飼養。

1.2大鼠CUMS抑郁模型制備根據Braun等〔8〕慢性應激程序制備大鼠CUMS程序。應激程序：食物及水的剝奪(各24 h)、5 min冷水強迫游泳(水溫4℃)、2 h束縛應激、20 min足底電擊(0.8 A，間隔5 min、每次持續4 s)、5 min懸尾(距離尾尖1 cm處)、晝夜顛倒，共7種刺激，除了禁食禁水及晝夜顛倒，其他應激均在每天上午9∶00～12∶00之間進行，每天一次連續4 w，應激刺激順序隨機安排。

1.3訓練方案①SM大鼠自第2周開始接受4 w CUMS應激程序(7種應激，每天一種，隨機安排)；② SEX組大鼠適應環境1 w后從第2周開始將大鼠放入配備了轉輪(直徑33 cm、寬度10 cm)的鼠籠里開始轉輪運動，大鼠可自由進跑輪進行轉輪運動，紅外線檢測裝置自動采集大鼠每天的轉輪距離、分析系統分析轉輪情況，大鼠允許適應自愿轉輪1 w；同時每天接受7種應激中的1種，為期4 w；③C組在整個實驗過程中不做任何其他干擾(除了每天例行鼠籠清潔)。

1.4下丘腦AChE及ChAT活性測定慢性應激及轉輪運動結束后第二天，將每組大鼠取6只處死，斷頭取全腦，置于冰盒上迅速分離下丘腦并稱重，用4℃生理鹽水將腦組織制成10%勻漿，將勻漿液離心20 min(3 000～4 000 r/min)，取上清液，比色法測定AchE及的ChAT活性(試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供)。

1.5心臟灌注及免疫組織化學染色慢性應激及轉輪運動結束后第二天，每組剩余4只大鼠行戊巴比妥鈉(60 mg/kg，腹腔注射)麻醉，仰臥位固定大鼠四肢，迅速開胸經左心室至升主動脈插管，剪破右心耳，先灌入150 ml生理鹽水沖洗血液，隨后先快后慢灌入4%、0.1 mol/L多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)300 ml，最后將腦置于0.1 mol/L PBS中脫水24 h直至腦組織沉于溶液底部。取全腦在恒溫冰凍切片機上做連續冠狀位切片(片厚40 μm)，下丘腦PVN區每4張切片取1張。切片經0.01 mol/L PBS漂洗后加入兔抗大鼠fos血清第一抗體(1∶400)，經PBS漂洗三次，隨后加入pH 7.4的PBS緩沖液孵育2 h(37℃)，再次放入PBS緩沖液漂洗后入含生物素標記的第二抗體羊抗兔IgG液(1∶100)，37℃ 室溫孵育1 h，漂洗之后按DAB顯色試劑盒進行顯色20 min，常規乙醇脫水、透明(二甲苯)、封片(中性樹脂)。

1.6下丘腦PVN c-fos分析根據大鼠腦立體定位圖譜，取每組2只大鼠下丘腦室旁核5張切片，盡量使每張切片在同一位置，在400倍顯微鏡下將切片輸入電腦拍片，用江蘇捷達形態學分析系統計算下丘腦PVN c-fos免疫陽性細胞的個數、面積及灰度。

1.7統計學處理采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析或Dunnetts法進行組間比較。

2結果

2.1自愿轉輪運動對慢性應激大鼠下丘腦AChE及ChAT活性的影響與C組比較，SM組大鼠下丘腦AChE及ChAT活性均顯著增強(P<0.01)，增加幅度分別為76%及38%；SEX組大鼠下丘腦AChE活性顯著增強(P<0.05)，下丘腦ChAT活性與C組比較無統計學差異(P<0.05)。經過4 w轉輪鍛煉，SEX組大鼠與SM組比較，AChE及ChAT活性均顯著下降(P<0.05)，下降幅度分別為11%及21%。見表1。

表1　各組大鼠下丘腦AChE及ChAT活性結果

與C組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與SM組比較：3)P<0.01，4)P<0.05；下表同

2.2自愿轉輪運動對慢性應激大鼠下丘腦PVN c-fos表達的影響光鏡下可見下丘腦PVN 內分布大量c-fos(呈三角形)，細胞核著色，100倍鏡下c-fos為黃褐色小圓點，400倍鏡下為棕黃色圓形或橢圓形神經元。見圖1。測量結果顯示：長期不可預知的慢性應激可以顯著上調下丘腦PVN內c-fos表達，SM組大鼠的c-fos免疫陽性細胞數量、面積及灰度值均顯著多于C組(P<0.01，P<0.05)；4 w轉輪運動顯著下調了慢性應激大鼠下丘腦PVN內c-fos的表達，與SM組比較，SEX 組大鼠c-fos免疫陽性細胞面積和數量均顯著減少(P<0.05)，灰度值無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2　各組大鼠下丘腦PVN c-fos 免疫陽性細胞表達結果

圖1　下丘腦PVN c-fos陽性神經元表達(×400)

3討論

研究發現，緊張應激性生活事件尤其是慢性長期的生活壓力與抑郁行為是一種劑量-反應關系，即生活中應激事件越多，抑郁癥的發病率就越高，抑郁癥狀也越嚴重。中樞Ach能系統與焦慮及抑郁樣行為有關，已成為誘發抑郁癥的危險因素之一〔9〕。應激尤其是慢性不可預測和無法控制的應激可能會增加大腦神經病理學的脆弱性，從而改變膽堿能系統的功能。AchE及ChAT活性常作為膽堿能神經元功能活動的標志或間接反映Ach含量的指標，AchE的活性與Ach的釋放有關，Ach釋放越多，AchE的活性越高〔10〕。本研究結果提示抑郁模型大鼠下丘腦膽堿能神經系統Ach代謝亢進。Das等〔11〕認為急性固定姿勢臥姿應激150 min大鼠大腦AchE活性下降，而同種刺激每天150 min連續5 d，大腦AChE活性與對照組比較無顯著變化，這或許由于同種刺激長期應激導致了大腦對同種刺激的適應。過度活躍的膽堿能神經系統可導致抑郁癥狀的發生〔12〕，Addy等〔13〕發現腹側被蓋區注射Ach受體拮抗劑東茛菪堿可產生抗抑郁行為，強迫游泳實驗中抑郁模型大鼠的不動時間顯著縮短，并呈劑量依賴性。Kaneko等〔14〕研究認為AchE抑制劑多奈哌齊可提高抑郁癥的認知功能，甚至已經被證明能夠逆轉慢性應激引起的海馬神經元的凋亡。有關抑郁癥發病機制的另一個假說是膽堿能-腎上腺素能功能平衡失調學說，膽堿能神經系統的亢進可以激活HPA軸，糖皮質激素皮質醇分泌增多，糖皮質激素(GCs)在調節大腦神經元的功能方面起重要作用，而研究認為高水平的GCs可以引起大腦膽堿能神經元的凋亡及急劇退化〔15〕。本實驗發現運動應激組大鼠下丘腦ChAT與AchE活性明顯下降，表明Ach釋放減少。本課題組以前研究發現4 w自愿運動可以改善慢性應激模型大鼠的抑郁樣行為〔16〕，因此可以推測，轉輪運動減弱cums大鼠抑郁樣行為(興趣喪失、探索能力下降等)可能與此運動在一定程度上糾正應激導致下丘腦膽堿能系統功能亢進抑制HPA軸功能活動有關，具體機制需進一步研究。

HPA軸激活及由此引起GCs分泌增加是應激反應的最重要特征，而下丘腦PVN是HPA軸活動的直接控制部位。Pacak等〔17〕認為損害大鼠PVN 可顯著減少垂體門脈血流中的促腎上腺皮質激素釋放激素(CRF)水平，還可導致血液循環中的促腎上腺皮質激素(ACTH)和GCs水平顯著下降，同時應激反應基本消失。

原癌基因c-fos作為信號傳遞通路的第三信使調節靶基因的表達，與細胞的生長、信號傳遞、學習記憶過程有關，可被生理、心理和病理等內源性或外源性刺激所誘導，可作為神經細胞損害、情感和行為改變的標志物。本研究結果顯示，長期慢性不可預知應激顯著上調下丘腦PVN原癌基因c-fos的表達，說明此部位很可能與長期CUMS引起的焦慮樣行為有關。研究認為，應激引起的c-fos激活與皮質醇過度分泌有關〔18〕，因此可以推測長期慢性應激引起的下丘腦PVN區c-fos 顯著增多與應激引起的下丘腦GCs的高分泌有關，而高濃度的GCs可能會導致下丘腦膽堿能神經元的急劇退化引起應激大鼠焦慮樣行為。本實驗觀察到的結果與其他一些研究結果存在差異，以前學者研究認為慢性重復應激后c-fos表達逐漸減弱〔19〕，而本實驗結果卻發現長期不可預知的多種應激刺激引起下丘腦PVN c-fos顯著增多，可能因為大鼠每次刺激的方式不同，因而在一定程度上避免了大鼠對多種刺激的習慣化，這可能是c-fos表達增強的另一個重要原因。本實驗還觀察到4 w自愿轉輪運動減少了慢性應激大鼠下丘腦PVN c-fos蛋白的表達，表明自愿轉輪運動下調下丘腦PVN fos 蛋白的表達可能是此運動抗抑郁的中樞作用機制之一。研究發現，c-fos可作為第三信使調節CRF的表達，進而控制ACTH的分泌，啟動HPA軸影響與應激有關的焦慮狀態及學習記憶能力下降〔20〕，而自愿轉輪運動可能通過下調下丘腦PVN 的c-fos 表達拮抗HPA軸功能亢進，糾正下丘腦膽堿能系統功能紊亂，從而改善應激模型大鼠的焦慮樣行為，但具體機制需進一步研究。

4參考文獻

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〔2016-01-17修回〕

(編輯郭菁)

基金項目：國家自然科學基金(30671019)；山西省自然科學基金(2014011041-6)

通訊作者：于芳(1968-)，女，教授，碩士生導師，主要從事運動與中醫康復研究。

〔中圖分類號〕G804.7

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3095-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.003

Effects of voluntary wheeling on acetylcholine metabolism within hypothalamus and C-fos expression within hypothalamus PVN in the chronic stress rats

CUI Jian-Mei,GUO Xu-Yue,YU Fang,et al.

College of Physical Education,North University of China,Taiyuan 030051,Shanxi,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the influence of the 4-week voluntary wheeling exercise on the acetylcholine metabolism within hypothalamus and c-fos expression within paraventricular nucleus (PVN) of the hypothalamus in the depressive rats induced by chronic unpredictable stress (CUMS).Methods30 Sprague Dawley male rats were randomly divided into the control (C,n=10),the stress model (SM,n=10) and stress exercise groups (SEX,n=10).The rats of SEX and SM groups received CUMS every day and lasted 28 days.At the same time,rats in SEX group received 4-week voluntary wheeling exercise.Then AchE and ChAT activities within hypothalamus were detected and c-fos expression within PVN of the hypothalamus was detected and analyzed by ABC immunohistochemical technique and semi quantitative.ResultsCompared with C group,AchE and ChAT activities were increased in hypothalamus and c-fos expression was enhanced in hypothalamus PVN in the SM group(P<0.01).Compared with SM group,AchE and ChAT activities were reduced (P<0.05) in hypothalamus and c-fos expression was decreased (P<0.01) in hypothalamus PVN in the SEX group.ConclusionsVoluntary wheeling exercise could rectify the acetylcholine hyperfunction within hypothalamus and weaken c-fos expression within hypothalamus PVN in depressive model rats.

【Key words】Voluntary wheeling exercise;Depressive rats;Hypothalamus;Cholinergic system;c-fos

1太原學院體育系2山西醫科大學汾陽學院

3山西體育職業學院

第一作者：崔建梅(1972-)，女，講師，碩士，主要從事運動與中醫康復學研究。