補中益氣湯對肺腺癌順鉑耐藥細胞株與順鉑敏感細胞株荷瘤BALB/c小鼠移植瘤P-gp蛋白表達的影響

高　原　王　哲　陳　奇　王　瑩　井　歡　潘　茜　于　丹　劉春英

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院病理教研室，遼寧　沈陽　110847)

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·基礎研究·

補中益氣湯對肺腺癌順鉑耐藥細胞株與順鉑敏感細胞株荷瘤BALB/c小鼠移植瘤P-gp蛋白表達的影響

高原王哲陳奇1王瑩井歡潘茜于丹劉春英

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院病理教研室，遼寧沈陽110847)

〔摘要〕目的探討補中益氣湯對肺腺癌順鉑(DDP)耐藥與敏感細胞株荷瘤BALB/c小鼠移植瘤P-gp蛋白表達的影響。方法體外培養肺腺癌順鉑耐藥株A549/DDP及敏感細胞株A549，接種于BALB/c小鼠腋窩皮下，荷瘤成功后給予順鉑或順鉑聯合低、中、高劑量補中益氣湯治療。實驗共分為10組：A549/DDP或A549荷瘤對照組、A549/DDP或A549荷瘤+順鉑組、A549/DDP或A549荷瘤+順鉑+低劑量補中益氣湯組、A549/DDP或A549荷瘤+順鉑+中劑量補中益氣湯組、A549/DDP或A549荷瘤+順鉑+高劑量補中益氣湯組。給藥結束后，測量移植瘤體積并計算藥物抑瘤率及抑瘤作用提高率，蛋白質印跡法檢測移植瘤組織P-gp蛋白的表達。結果順鉑對A549/DDP移植瘤體積無顯著影響(P>0.05)，而使A549移植瘤體積顯著縮小(P<0.05)；聯合低、中、高劑量補中益氣湯的A549/DDP及A549移植瘤體積均縮小(P<0.05)，抑瘤率均增加(P<0.05)，隨著中藥劑量的增加，移植瘤體積隨之縮小，抑瘤率隨之增加，抑瘤作用提高率也隨之增加；單獨順鉑可上調A549/DDP移植瘤組織中P-gp蛋白表達(P<0.05)，下調A549移植瘤組織中P-gp蛋白表達(P<0.05)；聯合低劑量補中益氣湯并未顯著下調A549/DDP及A549移植瘤組織中P-gp蛋白表達(P>0.05)；聯合中、高劑量補中益氣湯的A549/DDP及A549移植瘤組織中P-gp蛋白表達均顯著下調(P<0.05)，兩劑量間無差異(P>0.05)。結論在順鉑耐藥與順鉑敏感的肺腺癌移植瘤組織中，補中益氣湯均有縮小移植瘤體積、提高順鉑抑瘤率、下調P-gp蛋白表達的作用，尤以中、高劑量作用最顯著。

〔關鍵詞〕補中益氣湯；肺腺癌；順鉑；耐藥

腺癌臨床發病時多已發生淋巴結和(或)遠處臟器轉移，喪失了最佳手術時機，治療多以化學治療為主。肺腺癌一線治療以鉑類為基礎的聯合化療方案為首選，但越來越多的患者表現出對鉑類藥物耐藥，這種耐藥性還造成了患者對放療或其他不同藥理機制化學藥物的敏感性降低〔1〕，嚴重影響了肺腺癌的臨床療效。補中益氣湯治療晚期肺癌〔2，3〕具有補益肺氣之功效，可以改善肺癌晚期患者長期化療后常出現的面色萎黃、少氣懶言、惡心嘔吐、納呆食少、神疲乏力等脾胃虛弱、氣血不足的癥狀。同時，本課題組前期研究發現補中益氣湯含藥血清能干擾人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP的生長作用并逆轉其耐順鉑(DDP)作用〔4，5〕，但補中益氣在肺癌DDP耐藥形成過程中的分子機制尚未完全闡明。本研究以A549/DDP與DDP敏感細胞株A549荷瘤BALB/C小鼠為研究對象，檢測補中益氣湯對耐藥相關蛋白P-糖蛋白(P-gp)表達的影響。

1材料與方法

1.1細胞株及動物A549/DDP及A549細胞株均購于中國醫學科學院腫瘤研究中心。BALB/c 小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF級，6周齡，雄性，體重(18±2)g，動物許可證號SCXK(京)2012-0001。

1.2中藥及制備補中益氣湯根據新世紀版《方劑學》(中國中醫藥出版社，鄧中甲主編)中規定用藥及臨床常用劑量(黃芪18 g，甘草9 g，人參6 g，當歸3 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白術9 g)，全部藥材均購于遼寧中醫藥大學附屬醫院藥房，通過遼寧中醫藥大學藥理實驗室鑒定，加水浸泡30 min后按湯劑常規方法煎熬，過濾并濃縮成生藥含量為1 g/ml的藥液，冷卻后4℃保存。

1.3試劑DMEM培養基、RPMI-1640培養基、胎牛血清均購于美國HyClone公司；DDP購于大連美侖生物技術有限公司；P-gp兔抗鼠多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司；β-actin兔抗鼠多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發光液均購于沈陽萬類生物科技有限公司。

1.4移植瘤動物模型的制備在 37℃、5% CO2的孵育條件下，A549、A549/DDP細胞分別在含有10%胎牛血清的DMEM和RPMI-1640培養液中培養。分別將收集好的對數生長期的A549/DDP和A549細胞株，用無血清培養基調整細胞濃度至5×107/ml，按相應分組接種0.2 ml腫瘤細胞于裸鼠腋窩皮下。接種腫瘤細胞8 d后成瘤，表明移植瘤動物模型的制備成功。

1.5實驗分組及給藥60只BALB/c 小鼠適應性喂養2 w，按隨機數字表法分為10組，A組(A549/DDP荷瘤對照組)、B組(A549/DDP荷瘤+DDP)、C組(A549/DDP荷瘤+DDP+低劑量補中益氣湯)、D組(A549/DDP荷瘤+DDP+中劑量補中益氣湯)、E組(A549/DDP荷瘤+DDP+高劑量補中益氣湯)、a組(A549荷瘤對照組)、b組(A549荷瘤+DDP)、c組(A549荷瘤+DDP+低劑量補中益氣湯)、d組(A549荷瘤+DDP+中劑量補中益氣湯)、e組(A549荷瘤+DDP+高劑量補中益氣湯)，每組6只。按照“人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算出裸鼠等效劑量，設三個生藥劑量5.82(高劑量)、2.91(中劑量)、1.46 g/kg(低劑量)，接種瘤細胞第9天開始給予不同藥物干預。A組、a組蒸餾水灌胃，1 ml/只，2次/d；B組、b組10 mg/kg DDP腹腔注射，2次/d；C組、c 組低劑量補中益氣湯灌胃1 ml/只，2次/d，同時10 mg/kg DDP腹腔注射，2 次/d；D組、d組中劑量補中益氣湯灌胃1 ml/只，2次/d，同時10 mg/kg DDP腹腔注射，2次/d；E組、e組高劑量補中益氣湯灌胃1 ml/只，2次/d，同時10 mg/kg DDP腹腔注射，2 次/d。給藥25 d后，處死全部BALB/c小鼠。無菌剝取移植瘤，測量皮下移植瘤的最大長徑(a)和橫徑(b)，計算移植瘤體積：移植瘤體積=a×b2/2；計算各組藥物的抑瘤率：抑瘤率=(對照組瘤質量-藥物組瘤質量)/對照組瘤質量× 100%；抑瘤作用提高率(%)=(藥物組抑瘤率-對照組抑瘤率)/對照組抑瘤率×100%。

1.6移植瘤中P-gp蛋白的檢測采用蛋白質印跡法：提取總蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度；灌制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠；等量的細胞蛋白提取物通過SDS-PAGE電泳分離；轉移至PVDF膜上；將膜置于脫脂牛奶中封閉2 h；孵育一抗工作液(1∶400)，4℃過夜；室溫下孵育二抗工作液(1∶5 000)2 h；在PVDF膜上滴加ECL發光液；用凝膠圖像處理系統(Gel-Pro-Analyzer軟件)采集目的條帶，分析其光密度值(OD)。實驗結果用蛋白相對表達量表示，蛋白相對表達量=(待測組OD P-gp/待測組OD β-actin)/(對照組OD P-gp/對照組OD β-actin)。

1.7統計學處理使用SPSS17.0軟件行單因素方差分析、SNK法或秩和檢驗。

2結果

2.1BALB/c小鼠的一般狀態及致瘤率各組BALB/c小鼠荷瘤后活動良好，未出現明顯的拒食、躁動、便溏等癥狀。荷瘤8 d后，各組BALB/c小鼠均有腫瘤結節生長，瘤塊直徑達到2～3 mm，經病理學診斷符合肺腺癌組織學特征。各組BALB/c小鼠致瘤率均達到100%。

2.2各組BALB/c小鼠移植瘤體積及藥物的抑瘤率接種A549/DDP細胞的各組BALB/c小鼠，單獨DDP干預后移植瘤體積輕度縮小，但與對照組比較無統計學差異(P>0.05)，但聯合低、中、高劑量的補中益氣湯后移植瘤體積均顯著縮小，與對照組、DDP組比較均有統計學差異(P<0.05)，隨著補中益氣湯劑量的增加，移植瘤體積隨之縮小，DDP抑瘤率隨之增加，抑瘤作用提高率也隨之增加。見表1。

如表2所示，接種A549細胞的各組BALB/c小鼠，單獨DDP干預后移植瘤體積就已顯著縮小，差異有統計學意義(P<0.05)，聯合低、中、高劑量的補中益氣湯后移植瘤體積進一步縮小，與對照組、DDP組比較均有統計學差異(P<0.05)，隨著補中益氣湯劑量的增加，移植瘤體積隨之縮小，DDP抑瘤率隨之增加，抑瘤作用提高率也隨之增加。

表1　A549/DDP細胞荷瘤BALB/c小鼠各組移植瘤體積及藥物抑瘤率

與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

表2　A549細胞荷瘤BALB/c小鼠各組移植瘤體積及藥物抑瘤率

與a組比較：1)P<0.05；與b組比較：2)P<0.05

2.3各組BALB/c小鼠移植瘤組織中P-gp蛋白的表達A～E組中，單獨DDP干預后移植瘤組織中P-gp蛋白的表達(2.03±0.04)明顯上調，與對照組(設為1)比較有統計學差異(P<0.05)；聯合低劑量補中益氣湯并未進一步下調P-gp蛋白的表達水平(1.62±0.03)，與DDP組比較無統計學差異(P>0.05)；聯合中、高劑量補中益氣湯均可以顯著下調P-gp蛋白的表達(1.18±0.05,1.30±0.01,P<0.05)，但兩種劑量之間比較無統計學差異(P>0.05)，但仍高于對照組(P<0.05)。a～e組中，單獨DDP干預后移植瘤組織中P-gp蛋白的表達(0.66±0.12)明顯下調，與對照組(設為1)比較有統計學差異(P<0.05)；聯合低劑量補中益氣湯并未進一步下調P-gp蛋白的表達水平(0.61±0.03)，與順鉑組比較無統計學差異(P>0.05)；聯合中、高劑量補中益氣湯可以進一步下調P-gp的表達(0.52±0.05,0.47±0.01,P<0.05)，但兩種劑量之間比較無統計學差異(P>0.05)。見圖1，圖2。

圖1　A549/DDP細胞荷瘤BALB/c小鼠各組移植瘤組織中P-gp蛋白的表達

圖2　A549細胞荷瘤BALB/c小鼠各組移植瘤組織中P-gp蛋白的表達

3討論

補中益氣湯為金元時期著名醫家李東垣《內外傷辨惑論》的經典方，該方中重用黃芪，補中益氣、升陽固表；人參、白術、甘草甘溫益氣、健脾益胃；橘皮理氣行滯；當歸補血和營；升麻、柴胡協同黃芪、人參以升舉清陽之氣，全方健脾胃以治氣虛之本，升提下陷陽氣，以達培土生金之效。臨床研究表明，補中益氣湯聯合化療治療晚期肺癌，可有效提高患者生存質量、延長生存期，減輕化療引起的毒副反應，有效改善肺癌耐藥，提高肺癌臨床療效〔6，7〕。A549/DDP細胞為A549細胞經過長期耐藥篩選后獲得的耐藥株，其耐藥性質穩定，培養液中即使不加入DDP，其耐藥性變化不明顯，適合用于DDP耐藥與DDP敏感腫瘤組織的比較研究。兩種腫瘤細胞株均在接種8 d后成瘤，但在持續的DDP治療后，移植瘤的體積出現了不同的變化，A549/DDP移植瘤體積無變化，而A549移植瘤體積縮小。聯合補中益氣湯后，兩種移植瘤的體積均顯著縮小，與劑量呈正相關。進一步證實補中益氣湯對DDP耐藥與DDP敏感的腫瘤病灶均有縮小作用。P-gp是一種跨膜糖蛋白，主要分布于細胞膜上，其耐藥機制有賴于ATP的調節，P-gp與化療藥物結合后，能夠通過與ATP 結合并利用ATP提供的能量將細胞內的化療藥物逆濃度梯度泵出細胞外，使細胞內化療藥物處于無效的低濃度狀態，不能有效殺傷癌細胞，最終導致多藥耐藥(MDR)。早有臨床報道〔8〕，肺腺癌組織中P-gp表達率較高，與其他肺癌病理類型有顯著性差異，證實P-gp表達參與了肺腺癌多藥耐藥的形成。本研究發現，DDP治療后，A549/DDP移植瘤組織中P-gp蛋白表達顯著上調，而A549移植瘤組織中P-gp表達顯著下調，說明DDP可使耐藥腫瘤組織藥物泵增多從而導致耐藥的發生，而可使敏感腫瘤組織中藥物泵減少從而發揮化療藥物的作用。在耐藥腫瘤組織中，中、高劑量補中益氣湯可使DDP所致上調的P-gp蛋白水平下調；而在敏感腫瘤組織中，中、高劑量補中益氣湯可使DDP所致下調的P-gp蛋白水平進一步下調。說明無論在DDP耐藥還是DDP敏感腫瘤組織中，中、高劑量補中益氣湯均可使藥物泵數量減少，從而增加腫瘤細胞內DDP濃度，更有效地發揮殺傷腫瘤細胞的作用。本實驗結果揭示補中益氣湯可以下調DDP耐藥與DDP敏感腫瘤組織中P-gp的表達，證實該復合方藥可以通過抑制化療藥物泵的表達來干預肺癌DDP耐藥。

4參考文獻

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〔2015-12-17修回〕

(編輯郭菁)

基金項目：國家自然科學基金項目(No.81403303)；中國博士后科學基金面上資助項目(No.2014M551122)；中國博士后科學基金特別資助項目(No.2015T80266)；遼寧省自然科學基金項目(No.2013020178)

通訊作者：劉春英(1962-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事中醫藥治療腫瘤機制的研究。

〔中圖分類號〕R734.2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3089-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.001

Effect of Buzhong Yiqi decoction on the P-gp expression in transplantation tumor of BALB/c mice with lung adenocarcinoma cisplatin-resistant cells and cisplatin-sensitive cells

GAO Yuan, WANG Zhe, CHEN Qi,et al.

Department of Pathology, College of Basic Medical Science, Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang 110847, Liaoning,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of Buzhong Yiqi decoction on P-gp expression in transplantation tumor of BALB/C mice with lung adenocarcinoma cisplatin-resistant cells (A549/DDP) and cisplatin-sensitive cells (A549).MethodsThe lung tumor-bearing model was established by inoculation of A549/DDP cells and A549 cells into BALB/c mice subcutaneously. All the mice were randomly divided into A549/DDP or A549 bearing model, A549/DDP or A549 bearing model with DDP, A549/DDP or A549 bearing model with DDP and low dose of Buzhong Yiqi decoction, A549/DDP or A549 bearing model with DDP and medium dose of Buzhong Yiqi decoction, A549/DDP or A549 bearing model with DDP and high dose of Buzhong Yiqi decoction groups. Volume of transplantation tumor was measured. Tumor inhibitory rate and tumor inhibitory increasing rate were calculated. Western blot was used to detect expression of P-gp protein.ResultsDDP reduced the volume of transplantation tumor with A549 cells (P<0.05), however it did not reduce the volume of transplantation tumor with A549/DDP cells. Low, medium and high dose of Buzhong Yiqi decoction reduced the volume of transplantation tumor with A549/DDP cells and A549 cells, increased the tumor inhibitory rate (P<0.05). With the increasing concentration of Buzhong Yiqi decoction, the volume of transplantation was smaller, and the tumor inhibitory rate and the tumor inhibitory increasing rate were higher. DDP up-regulated P-gp protein expression of transplantation tumor with A549/DDP cells, however it down-regulated P-gp protein expression of transplantation tumor with A549 cells (P<0.05). Medium and high dose of Buzhong Yiqi decoction down-regulated P-gp protein expression of transplantation tumor with A549/DDP and A549 cells (P<0.05).ConclusionsIn the cisplatin-resistant and -sensitive lung tumor tissues, Buzhong Yiqi decoction reduces the volume of transplantation tumor, higher the tumor inhibitory rate, and down-regulats P-gp protein expression.

【Key words】Buzhong Yiqi decoction; Lung adenocarcinoma;Cisplatin; Drug resistance

1遼寧省體育科學研究所生理研究室

第一作者：高原(1980-)，女，博士，副教授，主要從事中藥調節腫瘤耐藥作用及其機制的研究。