繡球菌多糖提取方法的比較研究

楚　杰，劉守志，張　濤，何秋霞，劉可春

(山東省科學院生物研究所，濟南　250014)

?

繡球菌多糖提取方法的比較研究

楚杰，劉守志，張濤，何秋霞，劉可春

(山東省科學院生物研究所，濟南250014)

摘要：對繡球菌多糖提取方法做了初步研究，通過熱浸、超聲、剪切、高壓等單一或復合處理方法，摸索出提取的最佳方法：剪切高壓法，提取條件為高速剪切乳化機內10 000r/min剪切10min，高壓30min后，其提取率達到5.106%。

關鍵詞：繡球菌；多糖；提取法

繡球菌(Sparassiscrispa)，又名花椰菜菇、花瓣茸，是一種非常珍稀名貴的藥食兩用菌，含有十分豐富的多糖，具有很好的保健作用和較高的藥用價值。研究表明，繡球菌多糖有抗腫瘤作用[1-3]，可用于治療各種癌癥，此外，繡球菌多糖還可以提高動物的造血功能[4]、加強白細胞介素-6的生成，能誘導動物產生干擾素[5-7]、抑制愛滋病毒-1逆轉錄超過50%等功能[8]，由于其如此多的功能，逐漸成為研究的熱點。繡球菌多糖存在于其菌絲體和子實體中，但因繡球菌子實體生長緩慢，人工栽培周期太長，采用液體深層發酵法培養，周期短、成本低，能大大提高多糖的產量。因此本試驗針對繡球菌菌絲體多糖的提取工藝進行了比較研究，為繡球菌多糖開發利用提供科學依據。

1儀器與材料

1.1菌種

繡球菌，引自韓國朝鮮大學。

1.2試劑

氯仿、正丁醇、無水乙醇、36%HCl、NaOH(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.3儀器

SG-500高剪切乳化機(上海尚貴有限公司)；XW-80A旋轉混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；RE-6000 旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)； SHB-B95循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；BILON-2000CTG恒溫超聲波提取機(西安比朗生物科技有限公司)；SBA-40D生物傳感分析儀(山東省科學院生物所)。

1.4繡球菌多糖含量的測定[9]

取提取液1mL(或多糖1g)，加入5%鹽酸30mL，100℃水解5h，水解后冷卻至室溫，調節pH至中性，定容到100mL，用SBA-40D生物傳感器測定其葡萄糖含量，同時測定各提取液水解前樣品的葡萄糖含量為空白對照，計算多糖含量。

2方法與步驟

2.1繡球菌的培養

2.1.1培養基(1)斜面培養基：PDF培養基。(2)液體發酵培養基：20%土豆汁、0.1%硫酸鎂、0.3%磷酸二氫鉀、2%的淀粉、0.3%的蛋白胨、0.01%的復合維生素B1，pH 5.5。

2.1.2繡球菌菌絲體的培養與收集將繡球菌斜面菌塊接種于液體發酵培養基中，25℃培養至菌絲球長滿為止，5 000r/min離心，將菌絲體收集，存4℃冰箱保存備用。

2.2繡球菌多糖的提取

2.2.1熱浸法準確稱取菌絲體10g于錐形瓶中，加水100mL，振蕩混勻，然后85℃水浴1h，5 000r/min離心15min， 將殘渣再次加入100mL的水，振蕩混勻， 85℃水浴1h，二次浸提，將浸提液合并到一起，旋轉蒸發器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿：正丁醇=4∶1等體積加入，混勻后，10 000r/min離心15min，去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇，醇沉后離心，沉淀部分烘干即多糖。稱重并按1.3方法測定多糖含量。

2.2.2熱浸剪切超聲法準確稱取菌絲體10g于錐形瓶中，加水100mL，振蕩混勻，85℃水浴1h，再放入高速剪切乳化機中10 000r/min剪切10min，最后放入超聲波提取機中超聲30min(超聲2.0s，間隙2.0，時長30min)取出，5 000r/min離心15min，取上清液，旋轉蒸發器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿：正丁醇=4∶1等體積加入，10 000r/min離心15min去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇醇沉，烘干。稱重并按1.3方法測定多糖含量。

2.2.3剪切超聲熱浸法取菌絲體10g，加水100mL，振蕩混勻，10 000r/min剪切10min；超聲30min(超聲2.0s，間隙2.0，時長30min)；85℃恒溫水浴1h。離心取上清液，旋轉蒸發器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿：正丁醇=4∶1等體積加入，10 000r/min離心15min去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇醇沉，烘干。稱重并按1.3方法測定多糖含量。

2.2.4剪切熱浸法取菌絲體10g，加水100mL，振蕩混勻，高速剪切乳化機10 000rpm剪切10min；85℃恒溫水浴1h。5 000r/min離心15min，取上清液，旋轉蒸發器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿∶正丁醇=4∶1等體積加入，10 000r/min離心15min去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇醇沉，烘干。稱重并按1.3方法測定多糖含量。

2.2.5剪切超聲法取菌絲體10g，加水100mL，振蕩混勻，高速剪切乳化機10 000r/min剪切10min；恒溫超聲波提取機超聲30min(超聲2.0s，間隙2.0，時長30min)。離心取上清液，旋轉蒸發器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿：正丁醇=4∶1等體積加入，10 000r/min離心15min去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇醇沉，烘干。稱重并按1.3方法測定多糖含量。

2.2.6剪切高壓法取菌絲體10g，加水100mL，振蕩混勻，高速剪切乳化機10 000r/min剪切10min；然后121℃ 30min。離心取上清液，旋轉蒸發器減壓濃縮，取濃縮液，氯仿：正丁醇=4∶1等體積加入，10 000r/min離心15min去除雜蛋白。取上清液，加入80%的無水乙醇醇沉，烘干。稱重并按1.3方法測定多糖含量。

2.3試驗數據的處理

圖1　熱浸剪切超聲法與剪切超聲熱浸法比較

2.3.1熱浸剪切超聲法與剪切超聲熱浸法比較 由圖1數據可知，熱浸剪切超聲法收率為0.492 3g，其含糖量365mg/g；在相同質量菌絲體條件下，剪切超聲熱浸法的收率為0.5078g，其含糖量每克870mg/g。從數據看出，雖然步驟一樣，但前后順序不一樣，對多糖的提取結果影響很大，先剪切超聲再熱浸，更加有利于繡球菌多糖的浸出，這是因為經剪切超聲后菌絲體細胞壁破碎，經過熱浸，多糖被充分浸出，提高了多糖的溶出率，而先熱浸再剪切超聲，破碎后細胞內多糖并沒有完全溶出，因此，剪切超聲熱浸法比熱浸剪切超聲法提取效率高。

2.3.2剪切超聲法與剪切超聲熱浸法比較由圖2可知，在采用相同質量菌絲體下，剪切超聲法收率為0.304 7g，其糖含量為640mg/g；剪切超聲熱浸法收率為0.507 8g，其糖含量為870mg/g。因此，剪切超聲熱浸法收率和糖含量均比剪切超聲法要高。這是因為剪切超聲后，雖然菌絲體細胞破碎，但多糖并沒有完全得到釋放，只有再經過熱浸后多糖才能完全被提取出來。

圖2　剪切超聲法與剪切超聲熱浸法比較

2.3.3剪切超聲法，剪切熱浸法和剪切高壓法由圖3可知，在采用相同質量菌絲體下，剪切超聲法收率為0.304 7g，其糖含量為640mg/g；剪切熱浸法收率為0.472 8g，糖含量為790mg/g；剪切高壓法收率為0.600 7g，收率為850mg/g。3種方法收率呈現遞增趨勢，糖含量也呈現遞增趨勢。剪切高壓法的提取收率最高， 因為細胞經剪切后，細胞壁破碎，超聲法只是起到進一步破碎的作用，多糖并沒有溶出；熱浸起到了多糖溶出的作用；而高壓既有進一步破碎細胞的作用，又能使多糖組分溶出。

圖3　剪切超聲法、剪切熱浸法和剪切高壓法

2.3.4熱浸法與剪切熱浸法由圖4可知，在采用相同質量菌絲體下，熱浸法為0.394 2g，其糖含量為365mg/g；剪切熱浸法收率為0.472 8g，糖含量為790mg/g。說明在剪切的基礎上再熱浸能更好的釋放胞內多糖。

圖4　熱浸法與剪切熱浸法

3結論

本試驗為能更好地提取繡球菌菌絲體多糖，對從繡球菌菌絲體中提取多糖的方法進行了比較研究，選用剪切、熱浸、超聲、高壓等做為提取多糖的方法，通過單一或復合處理，采用生物傳感器測定多糖含量，對比了不同處理方法的提取效果，得出剪切高壓法提取效果最好。剪切高壓法利用剪切乳化機的剪切作用對繡球菌細胞壁的破壞與高壓對繡球菌菌絲體細胞壁結構進一步破壞并使多糖充分溶出，使其對多糖的提取收率增加，其提取率最高，達到5.106%，且含糖含量也高，因此是一種理想的提取繡球菌多糖的方法。◇

參考文獻

[1]何榮華.中國首次繡球菌研究栽培成功[J].中國食用菌，2005，25(1)：45.

[2]黃建成，李開本，應正河，等.繡球菌蛋白質的有營養評價[J].菌物研究，2007，5(1)：51-62.

[3]王偉科，袁衛東，周祖法.不同碳、氮源對繡球菌菌絲生長的影響研究[J].浙江農業科學，2007，1：47-49.

[4]Ohno N，Miura NN，Nakajima M，et al.Antitumor 1.3-β-D-glucan from cultured fruit body of sparassis crispa[J].Biol Pharm Bull，2000，23(7)：866-872.

[5]HaradaT，KawaminamiH，Miura NN， et，al.Cell to cell contact through ICAM-1-LFA-1and TNF-αsynergistically contributes to GM-CSF and subsequent cytokine synthesis in DBA/2 mice induced by 1.3-β-D-Glucan SCG[J].J Interferon Cytokine Res，2006，26(4)：235-247.

[6]HaradaT，Miura NN， AdachiY， et，al.IFN-rinduction by SCG 1.3-β-D-glucan from sparassis crispa in DBA/2 mice in vitro [J].J Interferon Cytokine Res，2005，25(3)：125-130.

[7]HaradaT，Miura NN， AdachiY， et，al.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)regulates cytokine induction by 1.3-β-D-glucan SCG in DBA /2 mice in vitro[J].J Interferon cytokine Res，2004，24(8)：478-489.

[8]Wang Z，et，al.Phylogenetic relationships of sparassis inferred from nuclear and mitochondrial ribosomal DNA or RNA Polymerase sequences[J].Mycologia，2004，96(5)：1015-1029.

[9]王子輝，楚杰，王君高，劉可春.酶電極法測定海藻糖含量[J].食品工業科技，2010，11：366-368.

(責任編輯李燕妮)

作者簡介：楚杰(1965—)，女，學士，研究員，研究方向：生物研究。

Comparative Study on Extraction Methods of Hydrangea Polysaccharide

CHU Jie，LIU Shou-zhi，ZHANG Tao，HE Qiu-xia，LIU Ke-chun

(Institute of Biology，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China)

Abstract：The extraction methods of hydrangea polysaccharide was preliminarily studied and through the contrast including hot dipping，ultrasonic，shear，high-pressure and using single or complex treatment method， we explored the best extraction method were cut and high-pressure treatment, cut 10min at 10 000r/min, and high pressure treatment 30min，its extraction rate could reach 5.106%.

Keywords：Sparassis crispa；polysaccharide；extraction method