加味苓桂術(shù)甘湯對(duì)腎纖維化大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)的影響

董小君　丁　斗　劉厚穎　王玲玲

1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校中醫(yī)系，貴州　遵義　563002；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川　成都　610075；3.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州　貴陽(yáng)　550002

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加味苓桂術(shù)甘湯對(duì)腎纖維化大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)的影響

董小君1，2丁斗1?劉厚穎3王玲玲3

1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校中醫(yī)系，貴州遵義563002；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川成都610075；3.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng)550002

【摘要】目的：觀察加味苓桂術(shù)甘湯對(duì)大鼠腎纖維化模型的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法：將40只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量加味苓桂術(shù)甘湯組與高劑量加味苓桂術(shù)甘湯組。按200mg/(kg·d)腺嘌呤灌胃建立大鼠腎纖維化模型。28d后采集血液標(biāo)本，檢測(cè)大鼠血清BUN、Cr水平的變化；留取腎組織，用于HE染色觀察腎組織病理改變及免疫組化方法檢測(cè)腎組織TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果：模型對(duì)照組血清BUN、Cr、腎組織TGF-β1較正常對(duì)照組明顯升高，加味苓桂術(shù)甘湯各組上述指標(biāo)較模型對(duì)照組明顯下降。結(jié)論：加味苓桂術(shù)甘湯可保護(hù)腎功能，通過(guò)下調(diào)TGF-β1表達(dá)延緩腎纖維化進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】加味苓桂術(shù)甘湯；腎纖維化；TGF-β1

腎纖維化(renal fibrosis，RF)是不同病因的慢性腎病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同通路和病理基礎(chǔ)，其發(fā)生機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，涉及細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子之間的相互作用[1]。其中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前公認(rèn)的最強(qiáng)致纖維化因子，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積與之密切相關(guān)，是促進(jìn)腎臟疾病進(jìn)展的重要因素。苓桂術(shù)甘湯源自《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》，原為中陽(yáng)不足之痰飲而設(shè)，以溫陽(yáng)化飲，健脾利濕為用。課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，在原方基礎(chǔ)上，擬定出具有補(bǔ)腎健脾、通絡(luò)消癥功效的加味苓桂術(shù)甘湯。臨床上用該方治療慢性腎臟病，取得了較好的療效。為進(jìn)一步探討加味苓桂術(shù)甘湯對(duì)腎纖維化的影響，本研究用腺嘌呤灌胃制作大鼠腎纖維化模型，通過(guò)觀察加味苓桂術(shù)甘湯對(duì)腎組織TGF-β1的影響，從細(xì)胞分子水平探討該方抑制腎纖維化的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠40只，體重200～250g，清潔級(jí)，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(黔)2012-0001。

1.2藥品與試劑加味苓桂術(shù)甘湯由土茯苓、桂枝、白術(shù)、炙甘草、法半夏、黃連、大黃、六月雪、淫羊藿、熟地、黃芪、太子參、三七、丹參、當(dāng)歸、車前子、川芎等組成，以上中藥均購(gòu)自貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院門診草藥局，制成低劑量含生藥量1.48g/ml與高劑量含生藥量2.96g/ml的中藥水煎液，4℃恒溫冰箱保存；腺嘌呤購(gòu)自昆明騰科科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，TGF-β1兔抗鼠多克隆抗體，SABC免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色劑，購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.3動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)方法將40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照組(Ⅰ組)、模型對(duì)照組(Ⅱ組)、低劑量加味苓桂術(shù)甘湯組(Ⅲ組)與高劑量加味苓桂術(shù)甘湯組(Ⅳ組)。造模根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，制備濃度為2.5%的腺嘌呤混懸液(每1g腺嘌呤溶于40ml生理鹽水)，按200mg/(kg·d)腺嘌呤給模型對(duì)照組和低劑量、高劑量加味苓桂術(shù)甘湯組連續(xù)灌胃28d(正常對(duì)照組給予同等劑量的生理鹽水)，誘發(fā)腎纖維化模型。實(shí)驗(yàn)第8天開(kāi)始進(jìn)行中藥預(yù)防干預(yù)，用藥劑量按照施新猷[3]動(dòng)物與人的藥物劑量換算方法換算得出，低、高劑量加味苓桂術(shù)甘湯組分別按生藥22.2、44.4g/(kg·d)灌胃，持續(xù)給藥3周，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組每天給予3ml的生理鹽水。

1.4標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)第29天采集標(biāo)本，采集標(biāo)本前禁水12h，禁食8h。將全部大鼠用10%戊巴比妥鈉麻醉后，股動(dòng)脈取血5ml，靜置20min，3000r/min離心10min后分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)血尿素氮(BUN)，血肌酐(Cr)含量。采血后即刻摘取大鼠腎臟，放入10%中性甲醛中固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，用于HE染色及免疫組織化學(xué)檢查。免疫組化結(jié)果應(yīng)用麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析[4]，每組選10張切片，每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)檢測(cè)10個(gè)不重疊視野，視野內(nèi)棕黃色染色區(qū)域?yàn)殛?yáng)性表達(dá)，以TGF-β1陽(yáng)性顆粒的平均光密度來(lái)反映 TGF-β1的表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1對(duì)大鼠一般情況的影響實(shí)驗(yàn)第8天開(kāi)始，模型對(duì)照組大鼠出現(xiàn)精神萎靡，食欲下降，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，毛色干枯，耳廓蒼白，目色淡紅，瞇眼，眼瞼浮腫，尾巴濕冷，行動(dòng)遲緩等現(xiàn)象。低、高劑量大鼠的精神狀態(tài)優(yōu)于模型對(duì)照組。正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，攝食正常，毛色光亮，耳廓紅潤(rùn)，活動(dòng)度大。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型對(duì)照組與低劑量加味苓桂術(shù)甘湯組，各死亡1只動(dòng)物。

2.2腎功能的檢測(cè)與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、低劑量加味苓桂術(shù)甘湯組大鼠血清BUN、Cr水平顯著或極顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，低、高劑量加味苓桂術(shù)甘湯組血清BUN、Cr水平極顯著下降(P<0.01)；加味苓桂術(shù)甘湯各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3病理學(xué)檢測(cè)光鏡下模型對(duì)照組與各加味苓桂術(shù)甘湯組大鼠腎組織均有不同程度的損傷，其中模型對(duì)照組損傷最重，高劑量加味苓桂術(shù)甘湯組損傷最輕。正常對(duì)照組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)未見(jiàn)異常。模型對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞彌漫空泡變性，纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，近球小管管腔內(nèi)見(jiàn)異物結(jié)晶體，結(jié)晶體呈放射狀，有金屬光澤，部分皮質(zhì)間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞進(jìn)入，部分腎小管管腔內(nèi)也見(jiàn)中性粒細(xì)胞堆積。低劑量加味苓桂術(shù)甘湯組腎臟病變較模型對(duì)照組減輕，少許腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞呈小灶狀浸潤(rùn)，纖維組織增生面積較小且局限。高劑量加味苓桂術(shù)甘湯組腎臟病理改變較模型對(duì)照組明顯減輕，腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯纖維化。見(jiàn)圖1。

組別nBUN/mmol/LCr/μmol/LI組1013.09±1.24 67.40±4.37 II組936.38±3.57##160.18±20.75## III組916.33±0.91#△△ 81.40±3.33#△△IV組1014.27±1.62△△75.68±5.17△△

注：與Ⅰ組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Ⅱ組比較，△△P<0.01。

2.4TGF-β1表達(dá)半定量分析與正常對(duì)照組比較，余各組TGF-β1表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，加味苓桂術(shù)甘湯各組均顯著下降(P<0.01)；加味苓桂術(shù)甘湯各組間TGF-β1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)比較　

組別nTGF-β1(平均積分光密度)I組109.49±0.50II組9151.94±15.52##III組988.40±16.74##△△IV組1084.80±10.73##△△

注：與Ⅰ組比較，##P<0.01；與Ⅱ組比較，△△P<0.01。

3討論

中醫(yī)認(rèn)為，腎纖維化屬于“溺毒”、“關(guān)格”、“水腫”等范疇[5]，其主要病機(jī)為脾腎虧虛、濕濁內(nèi)蘊(yùn)、瘀毒壅滯。課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出具有補(bǔ)腎健脾、通腑泄?jié)帷⒒钛铕龉πУ募游盾吖鹦g(shù)甘湯。方中黃芪、太子參、茯

苓、白術(shù)益氣健脾，促進(jìn)脾胃運(yùn)化和氣機(jī)升降恢復(fù)；熟地、淫羊藿、桂枝補(bǔ)腎填精溫陽(yáng)；大黃、黃連、車前子、半夏、六月雪利濕祛毒；當(dāng)歸、丹參、三七、牛膝、川芎養(yǎng)血活血化瘀。諸藥合用，共奏扶正祛邪，通絡(luò)消癥之效。通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)該方能夠緩解慢性腎衰患者臨床癥狀和體征，降低血清尿素氮、肌酐水平，改善腎小球?yàn)V過(guò)率。

多種細(xì)胞因子參與了腎纖維化的病理過(guò)程，主要影響腎小管細(xì)胞增生、肥大、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成等。其中，TGF-β1是促進(jìn)ECM合成與沉積的重要因子， 促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，打破腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)代謝的動(dòng)態(tài)平衡，使其向纖維化方向發(fā)展。TGF-β1幾乎參與腎纖維化的各個(gè)環(huán)節(jié)，是誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的中心環(huán)節(jié)。因此對(duì)抗TGF-β1以阻止腎臟纖維化對(duì)治療慢性腎功能衰竭具有重要意義，也成為一個(gè)公認(rèn)的治療靶點(diǎn)[6]。

研究通過(guò)加味苓桂術(shù)甘湯治療腎纖維化大鼠及其對(duì)腎組織TGF-β1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，加味苓桂術(shù)甘湯能降低腎纖維化大鼠血清BUN、Cr水平，且高劑量加味苓桂術(shù)甘湯組效果更明顯。同時(shí)，經(jīng)腺嘌呤灌胃后，模型對(duì)照組大鼠腎臟組織均出現(xiàn)不同程度的纖維化，TGF-β1呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)狀態(tài)，而用加味苓桂術(shù)甘湯干預(yù)后的各組TGF-β1表達(dá)均明顯減少，表明加味苓桂術(shù)甘湯可明顯保護(hù)腎功能，通過(guò)下調(diào)腎組織內(nèi)的TGF-β1表達(dá)，降低細(xì)胞外基質(zhì)合成，從而延緩腎纖維化的進(jìn)展。

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基金項(xiàng)目：遵義科技局青年人才項(xiàng)目(遵市科合社字[2012]30號(hào))。

作者簡(jiǎn)介：董小君(1983-)，女，江蘇靖江人，講師，2015級(jí)博士研究生，主要從事方劑功效發(fā)揮機(jī)理及應(yīng)用的研究。E-mail：57229463@qq.com. 通信作者：丁斗(1980-)，男，貴州遵義人，副教授，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)。E-mail：dingdou1980@sina.com

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)12-0053-02

(收稿日期：2016.04.18)

Effects of Jiawei Lingguizhugan Decoction on Expression of TGF-β1 in Renal Fibrosis Rats

DONG Xiaojun1,2DING Dou1?LIU Houying3WANG Lingling3

1.Traditional Chinese Medical Department of Zunyi Medical College，Zunyi 563002，China；2.Basic Medical College of Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China；3.The second Affiliated Hospital of Guiyang Traditional Chinese Medical College，Guiyang 550002，China

Abstract:Objective To observe the effects of Jiawei Lingguizhugan decoction in renal fibrosis rats and explore its possible mechanism. Methods 40 Wistar rats were randomly divided into four groups，namely the control group，the model group，the low-dose Jiawei Lingguizhugan decoction group and the high-dose Jiawei Lingguizhugan decoction group. The models of renal fibrosis were established by intragastric administration of adenine200mg/(kg·d). The blood samples were collected after 28 days. The changes of blood urea nitrogen and creatinine were detected. The kidney pathological changes were observed by light microscopy with HE-staining. The expression of TGF-β1 was determined by immunohistochemical method. Results Blood urea nitrogen，creatinine and TGF-β1 of the model group were markedly increased than that of the control group. The above indicators were lower in the low-dose and high-dose Jiawei Lingguizhugan decoction groups than those in the model group. Conclusions Jiawei Lingguizhugan decoction could protect the kidney function and postpone renal fibrosis by decreasing the expression of TGF-β1 in renal tissues.

Key words:Jiawei Lingguizhugan Decoction；Renal Fibrosis；TGF-β1