夏桑菊顆粒中迷迭香酸的含量測(cè)定

羅　勇　方鐵錚　姚江雄　許招懂　夏伯候　林麗美　李亞梅*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南　長(zhǎng)沙　410208；2.廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司，廣東　廣州　510208

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夏桑菊顆粒中迷迭香酸的含量測(cè)定

羅勇1方鐵錚2姚江雄2許招懂2夏伯候1林麗美1李亞梅1*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208；2.廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司，廣東廣州510208

【摘要】目的：夏枯草為夏桑菊顆粒的君藥，研究檢測(cè)夏枯草主要藥效成分迷迭香酸來(lái)建立夏桑菊的質(zhì)控指標(biāo)。方法：采用HPLC方法對(duì)夏桑菊中迷迭香酸含量進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)條件為色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18；流動(dòng)相：乙腈-1%醋酸(19∶81)洗脫；流速：1.0ml/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：329nm；進(jìn)樣量：10μl。結(jié)果：檢測(cè)得到迷迭香酸含量平均值為0.33mg/g，該方法的平均回收率為101.01%，線性方程為Y=2376737X-3261。結(jié)論：為提高夏桑菊顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)處方中夏枯草以迷迭香酸計(jì)的含量進(jìn)行研究，為更好的監(jiān)控和評(píng)價(jià)夏桑菊顆粒的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】夏桑菊顆粒；迷迭香酸；HPLC法

夏桑菊顆粒為夏枯草、桑葉、野菊花三味藥材經(jīng)加工制成，具有清肝明目、疏風(fēng)散熱、除濕痹、解瘡毒的功效、用于風(fēng)熱感冒、目赤頭痛、高血壓、頭暈耳鳴、咽喉腫痛、疔瘡腫毒等癥，并可作清涼飲料。夏桑菊顆粒原標(biāo)準(zhǔn)收載于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)(部頒標(biāo)準(zhǔn))第15冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3-B-2967-98。原標(biāo)準(zhǔn)收載了該藥品的處方、制法、性狀、鑒別、檢查、主治與功能、用量與用法、規(guī)格和貯藏九個(gè)項(xiàng)目。根據(jù)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高行動(dòng)計(jì)劃的要求，對(duì)夏桑菊顆粒原標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂。由于夏桑菊顆粒的君藥是夏枯草，參考2010版《中國(guó)藥典》選擇夏枯草主要藥效成分迷迭香酸為質(zhì)控指標(biāo)[1]，目前對(duì)夏枯草中迷迭香酸的含量測(cè)定已有研究[2-4]。迷迭香酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎活性和免疫抑制活性、抗血栓等[5-7]作用。2010年版《中國(guó)藥典》一部夏枯草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已制定了迷迭香酸的含量測(cè)定方法。為提高夏桑菊顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)處方中夏枯草以迷迭香酸計(jì)的含量進(jìn)行研究，為更好的監(jiān)控和評(píng)價(jià)夏桑菊顆粒的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器Shimadzu LC-20AT液相色譜儀(含柱溫箱、四元梯度系統(tǒng)、帶恒溫的自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、LCsolution色譜工作站)；Millipore Simplicity 185純水器；BP211D電子天平(Sartorius公司)；HN-1006超聲清洗儀。

1.2材料迷迭香酸(批號(hào)：Lot#0001432843，SIGMA-ALDRICH)；夏桑菊顆粒(廣州星群(藥業(yè))股份有限公司、廣州花城制藥廠、廣西億康藥業(yè)股份有限公司等);乙腈、醋酸、甲醇均為色譜純，水為自制超純水，其余試劑為分析純。

2方法

2.1色譜條件色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-1%醋酸(19∶81)洗脫；流速：1.0ml/min；柱溫：40℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng)：329nm；進(jìn)樣量：10μl。理論塔板數(shù)以迷迭香酸計(jì)不應(yīng)低于5000，在選定的條件下分離度為3.52。見(jiàn)圖1。

2.2對(duì)照品溶液制備精密稱(chēng)取迷迭香酸對(duì)照品適量，加甲醇使溶解，制成每1ml含迷迭香酸20μg的溶液，即得。

2.3樣品溶液制備本品研細(xì)，取2.5g，精密稱(chēng)定, 置50ml容量瓶中，加入75%甲醇40ml，超聲30min(功率250W，頻率33kHz)溶解，放冷后，補(bǔ)加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為樣品溶液。

2.4陰性對(duì)照液制備按處方組成，取除夏枯草外的其余藥味，按工藝要求制成不含迷迭香酸的夏桑菊顆粒。按“2.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行制備，即得。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱(chēng)取迷迭香酸對(duì)照品10.03mg，加甲醇定容到50ml，得濃度為194.58μg/ml的迷迭香酸對(duì)照品溶液；精密吸取濃度為194.58μg/ml的迷迭香酸對(duì)照品溶液5ml，加甲醇定容到50ml，得濃度為19.46μg/ml的迷迭香酸對(duì)照品溶液；再精密吸取濃度為19.46μg/ml的迷迭香酸對(duì)照品溶液5ml，加甲醇定容到50ml，得濃度為1.95μg/ml的迷迭香酸對(duì)照品溶液。將不同濃度的對(duì)照品溶液分別進(jìn)5、10μl，測(cè)得迷迭香酸峰面積。以迷迭香酸的進(jìn)樣量(μg)X為橫坐標(biāo)、迷迭香酸的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y=2376737X-3261，R2=1.00000，結(jié)果表明：迷迭香酸在0.01946～1.94582μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6精密度試驗(yàn)取同一對(duì)照樣溶液重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果，峰面積的平均值為366926.5，RSD為0.73%，表明該方法儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)為IA10378批夏桑菊顆粒，按供試品溶液配制方法，平衡操作配制6份，并依法測(cè)定。結(jié)果，測(cè)得含量平均值為0.33mg/g，RSD為0.63%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)取夏桑菊顆粒(批號(hào)：IA10378，含迷迭香酸0.33mg/g)，粉碎成細(xì)粉，分別取1.25g，精密稱(chēng)定，置6個(gè)50ml容量瓶中，分別精密加入適量迷迭香酸對(duì)照品，按供試品溶液配制方法配制，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，測(cè)得平均回收率為101.01%，RSD為0.35%，表明該法準(zhǔn)確度良好。

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別在1、2、3、4、5、6、7、8、12、18、24h進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果測(cè)得該樣品含迷迭香酸的平均含量為0.33mg/g，RSD為0.76%。結(jié)果表明在24h內(nèi)供試樣品的穩(wěn)定性良好。

2.10樣品的測(cè)定在“2.1”色譜條件下，依法檢測(cè)“2.3”的樣品溶液，按外標(biāo)法計(jì)算迷迭香酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　部分夏桑菊顆粒抽樣的迷迭香酸的含量測(cè)定

續(xù)表1　部分夏桑菊顆粒抽樣的迷迭香酸的含量測(cè)定

3討論

3.1提取條件首先對(duì)超聲提取及回流提取進(jìn)行對(duì)比考察，結(jié)果在提取率相同的條件下，超聲提取具有用時(shí)短、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，因此選用甲醇超聲提取。為充分提取樣品中迷迭香酸，實(shí)驗(yàn)以提取溶劑、提取時(shí)間、溶劑量作為3因素進(jìn)行提取方法正交試驗(yàn)篩選，由正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果表明，3因素對(duì)提取影響順序?yàn)椋軇┝?提取時(shí)間>提取溶劑，確定選用溶劑量為50ml，超聲30min，因提取溶劑對(duì)含量影響無(wú)顯著性差異，在為75%甲醇中樣品顆粒可全溶解，因此選用75%甲醇提取。

3.2波長(zhǎng)的選擇取迷迭香酸對(duì)照品適量，加入甲醇溶液配成對(duì)照品溶液，于紫外分光光度計(jì)上在190～400nm進(jìn)行掃描，迷迭香酸對(duì)照品在329nm處有最大吸收，選取329nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3流動(dòng)相選擇研究嘗試了甲醇-水、乙腈-1%醋酸、乙腈-0.1%磷酸等流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-1%醋酸溶液(19%～81%)水進(jìn)行分析，所得色譜的分離較好，峰型對(duì)稱(chēng)。

3.4不同色譜柱的比較取同一批號(hào)為IA10378批夏桑菊顆粒，按供試品溶液配制方法，平衡操作配制3份，分別用Zorbax Eclipse XDB-C18、Gemini 5μm C18110A、Hypersil ODS-2三種品牌的色譜柱測(cè)定，結(jié)果用三種品牌的色譜柱測(cè)定同一批號(hào)為IA10378的夏桑菊顆粒的迷迭香酸含量為3.36、3.27、3.22，RSD為2.16%。結(jié)果表明，既定的色譜條件，均適用于上述的色譜柱。

3.5含量限度的確定研究考察了星群公司近期樣品、3年有效期及過(guò)期1年內(nèi)的有糖及無(wú)糖型夏桑菊留樣中迷迭香酸含量情況，結(jié)果樣品中迷迭迭香酸含量均不低于2.0 mg/包。實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了其他19個(gè)不同生產(chǎn)廠家夏桑菊中迷迭香酸含量情況，結(jié)果樣品中迷迭香酸含量波動(dòng)較大(0.01～5.7mg/包)。考慮大生產(chǎn)及原材料藥材的波動(dòng)等因素影響，藥典規(guī)定夏枯草藥材迷迭香酸含量不得低于0.2%，一般轉(zhuǎn)移率不得少于20%，根據(jù)處方計(jì)算迷迭香酸含量應(yīng)不得低于2mg/包。

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基金項(xiàng)目：科技部“重大新藥創(chuàng)制”(2013ZX09201019)；公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201507002)；湖南省十二五重點(diǎn)學(xué)科藥學(xué)學(xué)科資助。

作者簡(jiǎn)介：羅勇，男，在職研究生，主管藥師，主要從事藥物分析研究。Email:sword4318@qq.com 通信作者：李亞梅(1987-)，女，碩士，主要從事中藥藥理與質(zhì)量研究。Email:liyamei163@163.com

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)12-0044-03

(收稿日期：2016.04.29)

Determination of Rosmarinic Acid in Xiasangju granules

LUO Yong1FANG Tiezheng2YAO Jiangxiong2XU Zhaodong2XIA Bohou1LIN Limei1LI Yamei1

1.School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208,China;2.Guangzhou Xingqun Pharmaceutical Co．，Ltd．，Guangzhou 510288，China

Abstract:Objective Prunella valgaris is the monarch drug of Xiasangju granules, in this study to establish a quality control for Xiasangju granules by detecting rosmarinic acid in Prunella.Methods Determine the rosemary acid in Xiasangju granulesby HPLC,the detection conditions,Column Zorbax Eclipse XDB-C18; mobile phase: acetonitrile-1% acetic acid (19∶81) to give; flow rate: 1.0ml/min; column temperature: 40℃; detection wavelength: 329nm; injection volume: 10μl.Results The average content of rosemary acid was 0.33mg/g, the average recovery of the method was 101.01%, the linear equation was Y=2376737X-3261.Conclusion This study can improve Xiasangju pranules quality standards, prescription Prunella meter with rosemary acid content were studied to provide a scientific basis for better quality monitoring and evaluation Xiasangju granules.

Key words:Xiasangju granules Rosmarinic Acid UV HPLC