肺癌3p缺失區基因傳感器的研究

李 瓊* 伍 輝（重慶市渝北區人民醫院檢驗科，重慶 401120）

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肺癌3p缺失區基因傳感器的研究

李 瓊* 伍 輝
（重慶市渝北區人民醫院檢驗科，重慶 401120）

【摘要】目的 研究3p缺失區基因傳感器，早發現人類個體的基因缺失，以便預測、預防肺癌的發生，即使有早期肺癌，本人積極參與治療，也是可以治愈的。方法 采用電化學中的循環伏安法與金電極的自組裝法對缺失的靶基因進行檢測。結果 自組裝的金電極用循環伏安法可檢測出缺失的靶基因。結論 對3p多個缺失基因的檢測，可早預防、預測、治療肺癌，具有較好的臨床意義。

【關鍵詞】3p缺失區；基因傳感器；肺癌；金電極；循環伏安法

醫學模式是認識健康與疾病等醫學問題的思維方法，國家衛生部陳竺部長反復提出與解釋的“4P”醫學模式［1］即預防性（Preventive）、預測性（Predictive）、個體化（Personalized）和參與性（participatory）更加證明了疾病的預防、預測、早診斷、早治療的重要性，同時強調干預個體生活行為以達到預防疾病、控制發展的目標。

肺癌是世界范圍內的主要惡性腫瘤。其發病率和病死率在許多發達國家已上升為惡性腫瘤的第一位。跟大多數腫瘤一樣，發展成肺癌需要很長時間，有的需要10年以上，而3p（人類3號染色體短臂）基因部分缺失3年以前就發生了［2-3］。如果3p缺失基因早測出，提出相應的保健干預措施，對肺癌的早期預防、預測、診斷具有非常重要的意義，同時也是“4P”醫學模式的一個佐證。

電流型基因［4-5］傳感器即將已知序列的單鏈多核苷酸臉（ssDNA）固定在電極上（該課題是金電極），當電極的單鏈核酸與互補靶序列雜交形成雙鏈分子時，能表現出一定的物理信號（電流）改變，可通過電子學等技術將信號放大而顯示。該電流型基因傳感器檢測肺癌基因缺失的方法是一種簡單的、可靠的DNA雜交基因傳感器。

該課題基于“4P”醫學模式與電流型基因傳感器的可行性，以金為基底，通過巰基與金電極形成Au-s鍵自組裝法固定基因探針，實現對3p缺失區的基因檢測，為肺癌的預防、預測、早診斷提供一個新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器：電化學工作站（辰華CHI660，上海辰華儀器有限公司），金電極（直徑3 mm，天津市高仕睿聯科技有限公司），移液器，Thermo，LIBROR AEL-200電子天平（日本島津公司），BRANSON B3200S-T超聲清洗儀（上海必能信超聲公司）。

1.2 試劑：鐵氰化鉀（5 mmol/L），DNA固定與雜交緩沖液（TE Buffer組成濃度：10 mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH=8.0），3p缺失的4個基因的探針序列見表1。

表1 DNA序列表

1.3 方法

1.3.1 金電極的活化：金電極分別用1.0 μm和0.05 μm A12O3粉在鹿皮上打磨光亮后，用蒸餾水沖洗干凈，分別在蒸餾水、無水乙醇、蒸餾水中超聲洗滌10 min；然后將金電極浸泡在piranha（30%H2O2∶98%H2SO4=1∶3v/v）中10分鐘，取出在室溫下晾干待用。然后將一支活化金電極在5 mmol/L鐵氰化鉀緩沖溶液中循環伏安（CV）法掃描，掃速為0.1 V/s，掃描電壓為0.6～-0.2 V，持續掃描直到穩定的CV圖（圖1中的b）。

1.3.2 基因傳感器的制備：將0.5 μmol/L探針液體取5 μL滴加到活化的金電極表面，冰箱0～4 ℃中過夜，通過Au-S自組裝成膜。然后金電極在5 mmol/L鐵氰化鉀緩沖溶液中循環伏安（CV）法掃描，掃速為0.1 V/s，掃描電壓為0.6～-0.2 V，持續掃描直到穩定的CV圖（圖1中的a）。

圖1 活化金電極與組裝金電極的CV圖（a：組裝金電極；b：活化金電極）

1.3.3 探針濃度的選擇：以系列探針濃度（以SEMA3B為例，探針濃度依次：0.1、0.5、1.0 μmol/L）液體取5 μL滴加到活化后的金電極表面，冰箱0～4 ℃中過夜，通過Au-S自組裝成膜，然后組裝金電極在5 mmol/L鐵氰化鉀緩沖溶液中循環伏安（CV）法掃描，掃速為0.1 V/s，掃描電壓為0.6～-0.2 V，持續掃描直到穩定的CV圖（圖2），以便選擇組裝探針液濃度那個濃度最恰當。結合其他3個基因CV掃描峰電流情況，該課題選出固定探針濃度0.5 μmol/L。

1.3.4 靶基因濃度線性范圍：滴加5 μL探針液（濃度0.5 μmol/L）在活化金電極表面，0～4 ℃過夜成膜，取出用TE緩沖液小流量沖洗自然干，滴加5 μL不同濃度的靶基因在組裝金電極膜表面，37 ℃雜交2 h，取出用TE緩沖溶液沖洗自然干，然后在5 mmol/L鐵氰化鉀緩沖溶液中循環伏安（CV）法掃描，掃速為0.1 V/s，掃描電壓為0.6～-0.2 V，持續掃描直到穩定的CV圖，其響應電流隨靶基因濃度的增加而不斷減小（圖3），且對不同濃度的靶基因作線性關系圖（圖4）。靶基因濃度：0、10、30、50、70、100、120、130（0.01 pmol/L）

圖2 不同探針濃度的CV圖（a：1.0 μmol/L b：0.5 μmol/L c：0.1μmol/L）

圖3 不同靶基因濃度的CV圖 圖4 不同濃度的靶基因線性關系圖

2 結果與討論

2.1 活化金電極與探針膜的cv表征：圖1b是活化裸金電極的cv圖表征，它的氧化峰和還原峰電流峰很典型，a表示探針膜的cv圖表征，它的氧化峰和還原峰電流有所下降，這是因為單核苷酸鏈通過Au-S自組裝到到金電極上，部分阻礙了電子的傳遞。同時表示探針成功組裝到金電極上。

2.2 基因傳感器自組裝不同探針濃度的cv表征（圖2）：從c到a氧化峰電流與還原峰電流均降低，是因為組裝的探針濃度從低到高，電子傳遞進一步被阻礙，因此電流降低。同時表示組裝電極具有生物活性。

2.3 用自組裝基因傳感器分別測定靶基因濃度cv表征（圖3）：氧化峰電流與還原峰電流隨著靶基因濃度升高其峰電流降低，是因為雜交作用，隨著濃度的增加，電子傳遞進一步被阻礙，因此電流降低。同時表示組裝電極具有生物活性，能與對應的核苷酸單鏈發生雜交反應。圖4的靶基因線性關系圖看出，其濃度在10～100（0.01 pmol/L）成線性。圖3與圖4表示該基因傳感器可以檢測3p缺失基因。

3 結 論

利用自主裝Au-S固定基因探針，成功構建了靈敏的電流型肺癌基因傳感器。與傳統方法相比，該方法有以下三個突出優點：①能早期篩查出肺癌發生的可能性；②自組裝固定提高靈敏度；③在本實驗中，以ssDNA固定作為基因模型，實驗了該方法對肺癌缺失基因的檢測，同時該方法可推廣到其他基因的測定，在臨床早診斷方面有著重要的應用，為4P醫學的預防、預測、早診斷、個體化提供理論證據。

參考文獻

［1］ 暴樹生，師新宇.用4P醫學理念構建和諧醫患關系的探討［J］.衛生軟科學，2012，26（11）：954-957.

［2］ 梅新宇，孫余婕，徐美青，等.非小細胞肺癌3p染色體多區域雜合性缺失檢測的研究［J］.中國肺癌雜志，2008，11（4）：534-537.

［3］ 翟艷輝，李瑩，胡文利，等.染色體3p21.3缺失區域11個相關基因在非小細胞肺癌中的表達［J］.中國肺癌雜志，2009，12（8）：853-858.

［4］ 周殿明，吳一丹，劉佩，等.電化學DNA傳感器［J］.化學傳感器，2011，31（1）：10-17.

［5］ 譙康全，吳永強，劉新露.新型肺癌壓電DNA傳感器的研制［J］壓電與聲光，2012，34（2）：249-252.

中圖分類號：R734.2

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）16-0036-02

基金項目：重慶市醫學科研計劃項目（編號：2012-2-297）

*通訊作者