雙酶梭菌TK6的篩選及益生物質對其代謝活力的影響

李敬杰，劉金輝，王海寬（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

雙酶梭菌TK6的篩選及益生物質對其代謝活力的影響

李敬杰，劉金輝，王海寬
（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

本實驗采用傾注法從健康成年人的糞便中篩選雙酶梭菌（Clostridium bifermentans）TK6，該菌有益于反芻動物，其發酵產物有消化酶、短鏈脂肪酸以及α-酮異己酸（KIC）等益生物質.分別利用7種低聚糖（低聚葡萄糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、棉籽糖以及水蘇糖）為唯一碳源進行TK6的對比發酵，測定其不同發酵液中短鏈脂肪酸、異丁酸、α-酮異己酸、消化酶等益生物質的含量.實驗結果表明：不同低聚糖作為唯一碳源對TK6的生長促進程度不同，并對其產生的水解酶、短鏈脂肪酸等物質有不同的影響.菌株TK6利用低聚異麥芽糖為唯一碳源時，其活菌數最大，為（7.97±0.16）×108，mL-1；并且其產乙酸、丁酸的促進作用最大，分別為（65.70±0.37）mmol/L和（53.51±0.52）mmol/L；產纖維素酶活力最高，達到（1，994.84±254.52）U/mL.菌株利用低聚木聚糖為唯一碳源時，其發酵液產木聚糖酶的酶活力最高，為（135.86±1.82）U/mL；利用低聚果糖為唯一碳源時，其發酵液蛋白酶活力最高，為（10.12±4.34）U/mL.當添加150，mmol/L的L-亮氨酸，37，℃孵化4，h時，KIC產量最高為（8.18±0.06）mg/L.

雙酶梭菌；功能性低聚糖；短鏈脂肪酸（SCFA）；水解酶

反芻動物經過長期進化形成了依靠瘤胃微生物的發酵作用降解、利用飼料的消化系統.有報道指出瘤胃微生物對反芻動物機體的蛋白質和糖類代謝、維生素合成消化、降解低聚糖以及發酵產生短鏈脂肪酸提供能量等都有相當重要的作用［1］.用芽胞桿菌菌制劑飼喂奶牛，可改善牛乳的質量，并可顯著增加產奶量；飼喂犢牛，可顯著增加犢牛的日增重，以及提高對犢牛的大腸桿菌性下痢的治愈率；飼喂綿羊，可增加綿羊對纖維素的利用率［1-3］.雙酶梭菌代謝產物范圍很廣，包括各種有機分子等碳水化合物、有機酸、醇類、芳香族化合物、氨基酸、胺類、嘌呤和嘧啶［4］.雙酶梭菌是嗜溫細菌，嚴格厭氧，革蘭氏陽性，產芽胞，芽胞卵圓，中到次端生，有一個厚的芽胞壁，發酵產丁酸、異丁酸與消化酶，耐酸堿、高溫，耐受飼料的加工儲藏與胃的酸性環境等，在腸道內可萌發為有新陳代謝作用的益生細胞，其發酵液中含有較高活性的消化酶，對植物碳水化合物有較強的降解能力，并能提高飼料轉化率，是優良的益生菌候選者［5］.因此，雙酶梭菌替代抗生素添加到反芻動物的飼料中，是本實驗研究的目標方向.益生菌、有機酸、酶制劑等微生態制劑調控反芻動物的營養代謝途徑，并對改善瘤胃發酵、促進動物生長、提高免疫力有一定功效，是潛在的抗生素替代產品［6-7］.

本文從健康成年人的糞便中篩選高產酶與短鏈脂肪酸（SCFA）益于反芻動物的雙酶梭菌，測定雙酶梭菌利用7種低聚糖發酵結果，并對產生的各種益生物質進行測定，旨在為雙酶梭菌合生元的開發以及反芻動物的候選益生菌提供了理論基礎與應用依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

取天津本地的23～30歲健康成年人的新鮮糞便約10，g，溶于90，mL滅菌后的生理鹽水中，稀釋均勻.

1.1.2 培養基

計數培養基（g/L）［8］：葡萄糖5.0，蛋白胨20.0，瓊脂10.0，pH 7.4.

BHI培養基（g/L）：胰蛋白胨10.0，牛心浸粉17.5，NaCl 5.0，葡萄糖2.0，K2HPO4·12H2O 2.5，pH 7.4，121，℃滅菌20，min.

RCM培養基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉粉10.0，酵母粉3.0，葡萄糖5.0，可溶性淀粉1.0，NaCl 5.0，醋酸鈉3.0，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，瓊脂0.5，pH 6.8，121，℃滅菌20，min.

低聚葡萄糖（glucoseoligosaccharides，GLOS）培養基（g/L）：低聚葡萄糖5，蛋白胨10，K2HPO45，MgSO40.2，MnSO40.2，pH 7.4，115，℃滅菌20，min.

分別用低聚半乳糖（galatooligosaccharides， GOS）、低聚異麥芽糖（isomaltooligosaccharides，IMOS）、低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS）、低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）、水蘇糖及棉籽糖替代種子培養基中的低聚葡萄糖（GLOS）作為唯一碳源，其他成分不變.實驗用功能性低聚糖的組成與結構見表1.

表1 實驗用功能性低聚糖組成與結構Tab. 1Composition and structure of functional oligosaccharides

1.2 實驗方法

1.2.1 傾注法篩選

用滅菌吸量管吸取樣品1，mL，注入含有9，mL生理鹽水的試管中，另換1支1，mL滅菌吸量管反復吹吸數次，此液為1﹕10稀釋液。按上述操作順序做10倍遞增稀釋液。吸取10-5、10-6、10-7這3個梯度稀釋液于已滅菌的平板中，每個稀釋度做3個平板，然后將冷卻至50，℃左右的RCM固體培養基注入平板中，并轉動平板使之與樣液混勻，待培養基凝固后，37，℃厭氧培養（H2、CO2與N2的體積比為1﹕1﹕8）12，h.反復兩次挑取單菌落，直至平板上只含有大小形態都相同的單一菌落.挑取單菌落于10，mL的BHI液體培養基試管中，37，℃厭氧培養（H2、CO2與N2的體積比為1﹕1﹕8）19，h，1﹕1保存于60%，的甘油管中，-70，℃冰箱保存.

1.2.2 提取基因組，PCR擴增16S，rDNA測序

采用酚氯仿抽提法提取分離菌株的基因組，菌株TK6通過16S rDNA方法鑒定。篩選分離出的菌株由北京六合華大基因技術有限公司進行16S rDNA測序.使用NCBI BLAST軟件在DDBJ/EMBL/Gen-Bank中使用參考菌株同源性進行搜索.

1.2.3 活菌計數

取1，mL樣品用9，mL的無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取1，mL適當的稀釋梯度于裝有9，mL的計數培養基的厭氧管內，37，℃厭氧培養36，h［8］.

1.2.4 發酵上清液的制備

從甘油管中接0.1%，的菌體于10，mL BHI液體培養基中，厭氧培養19，h后，振蕩混勻，取2，mL菌液于裝有40，mL不同功能性低聚糖的液體培養基的50，mL的圓底燒瓶中，厭氧培養32，h.取5，mL的液體于5，mL的EP管中，12，000，r/min離心10，min，取上清液，即為發酵液.

1.3 菌株TK6的發酵產物測定

1.3.1 消化酶活性的測定

采用GB/T 23527—2009，Folin試劑顯色法測蛋白酶活性［9］，采用CMC-糖化力法測定纖維素酶活性［10-11］，參考王振華［1］的方法測定木聚糖酶活性.

1.3.2 短鏈脂肪酸（SCFA）濃度的測定

參考Wang等［8］的方法進行發酵樣品處理，SCFA標準品混合物包括乙酸、丁酸、異丁酸，采用外標法繪制標準曲線，確定樣品中SCFA濃度［12］.

1.3.3 α-酮異己酸（KIC）含量的測定

雙酶梭菌于10，mL BHI液體培養基中，厭氧培養19，h后，取2，mL菌液轉接于40，mL的發酵培養基中（做5組對照），37，℃厭氧培養24，h.在超凈臺中分別向5個圓底燒瓶中加入不同濃度的前體物L-亮氨酸（25、50、75、100、150，mmol/L），厭氧培養1、2、3、4、5，h后，分別取1，mL，離心取上清液，過膜處理.利用紫外高效液相色譜法測定KIC含量［13］.

2 結果與分析

2.1 雙酶梭菌的分離鑒定

實驗通過傾注法分離培養后分離出11 株單菌落.根據《伯杰細菌鑒定手冊》［14］，雙酶梭菌為革蘭氏陽性（G+）菌，嚴格厭氧，菌體直或微彎，產芽胞，芽胞卵圓，偏心到次端生，菌株 B2、B6、C7、TK6符合要求.將得到的 4組序列在NCBI 數據庫中進行16S rDNA 序列同源性比對，B2、B6、C7、TK6與雙酶梭菌（C. bifermentans）的同源性分別達98%、99%、98%、100%，均屬于梭菌屬雙酶梭菌種.由于菌株TK6同源性達到100%，且等同條件下生長最旺盛，因此本文選定TK6進行深入研究.

2.2 雙酶梭菌TK6體外發酵

2.2.1 不同功能性低聚糖對雙酶梭菌TK6菌體濃度的影響

功能性低聚糖不同的單體組成和結構影響其在腸道的發酵與SCFA的合成［15］，雙酶梭菌TK6對不同功能性低聚糖的微生物利用率可以通過發酵結束獲得的菌體濃度來判斷，結果見表2.

表2 不同功能性低聚糖對雙酶梭菌TK6菌體濃度的影響Tab. 2Effect of different functional oligosaccharides on the growth of C. bifermentans TK6

不同的低聚糖結構顯著影響雙酶梭菌TK6的發酵效果，實驗中7種功能性低聚糖都能被雙酶梭菌TK6不同程度利用，`其中，IMOS與GOS表現出對益生菌雙酶梭菌TK6顯著的促生長益生功能。雙酶梭菌TK6發酵IMOS獲得的菌體濃度最高，達到（7.97±0.16）×108，mL-1，利用GOS獲得的菌體濃度高于棉籽糖和水蘇糖，而對FOS以及XOS的利用率不高.

2.3 雙酶梭菌TK6體外發酵水解酶活性

分別利用7種低聚糖為碳源發酵后，測定纖維素酶活力，結果如圖1所示.由圖1可知，菌株利用IMOS時，其發酵液產纖維素酶活力最高，達到（1，994.84±254.52）U/mL，其次是GOS與XOS，產量分別達到（1，536.69±203.62）U/mL與（811.30± 139.98）U/mL，可能是IMOS、GOS與XOS都有α-1，4糖苷鍵.分別利用7種低聚糖為碳源發酵后，測定纖維素酶活力，結果如圖2所示，菌株利用XOS發酵產木聚糖酶的酶活力最高，為（135.86± 1.82）U/mL。木聚糖的單體主要為木糖，木聚糖酶水解以木糖為底物.分別利用7種低聚糖為碳源發酵后，測定蛋白酶酶活力，結果如圖3所示，利用FOS發酵時，蛋白酶酶活力最高為（10.12±4.34）U/mL.

圖1 利用7種低聚糖測定纖維素酶活力Fig. 1Cellulase activity using seven functional oligosaccharides

圖2 利用7種低聚糖測定木聚糖酶活力Fig. 2 Xylanase activity using seven functional oligosaccharides

圖3 利用7種低聚糖測定蛋白酶活力Fig. 3 Protease activity using seven functional oligosaccharides

由圖1—圖3可知，雙酶梭菌同時具有蛋白酶、纖維素酶與木聚糖酶的活性，楊勝坤等［7］報道雙酶梭菌制劑飼喂家兔，促進家兔的生長與腸道消化酶活性的增強，提高飼料的利用率.王振華［1］認為芽胞桿菌制劑提高反芻動物消化酶活性是微生態制劑促進反芻動物生長作用的一個重要因素.雙酶梭菌TK6厭氧發酵產生的水解酶可以降解飼料中的植物粗纖維、蛋白質、碳水化合物、脂肪、淀粉、可溶性糖及纖維素，改善其吸收方式，提高飼料營養成分的轉化率，獲得生長、繁殖所需能量和各種營養物質，間接固定粗纖維的能量，促進反芻動物生長［16］.雙酶梭菌TK6有望作為良好的益菌制劑添加到反芻動物的飼料中. 2.4 雙酶梭菌TK6體外發酵不同功能性低聚糖產短鏈脂肪酸的特點雙酶梭菌TK6發酵不同種類的功能性低聚糖短鏈脂肪酸終產物主要是乙酸和丁酸（圖4），并以乙酸為主.功能性低聚糖的不同種類對異丁酸的產量影響不顯著，相比于對照組及其他功能性低聚糖，雙酶梭菌TK6對IMOS的發酵產生相對最高的乙酸和丁酸，分別達到（65.70±0.37）、（53.51±0.52）mmol/L；其次是GOS與水蘇糖，其乙酸與丁酸產量均較高，乙酸產量分別為（58.53±0.81）、（49.06±0.43）mmol/L，丁酸產量分別為（42.90±0.47）、（34.36± 0.10）mmol/L；對GLOS、XOS與FOS的利用率較低.數據顯示，丁酸梭菌TK2發酵不同功能性低聚糖代謝產生的短鏈脂肪酸量與菌體濃度成正相關［8］，同時，再一次證明了雙酶梭菌TK6對XOS與FOS兩種功能性低聚糖的利用率不高.

圖4 雙酶梭菌TK6利用功能性低聚糖產乙酸、丁酸、異丁酸Fig. 4C. bifermentans TK6，using functional oligosaccharide production acetate，butyrate and isobutyrate

雙酶梭菌利用7種低聚糖發酵產生大量的短鏈脂肪酸，產生的乙酸含量最高.Prohaszka等［17］報道乙酸能提高奶牛的泌乳量，特別是顯著提高乳脂率.反芻動物從消化道中吸收的碳水化合物主要是SCFA，SCFA約占反芻動物吸收能量的70%～80%，而乙酸是產量最大的SCFA.王振華［1］報道有機酸使腸道中的pH、EH值維持在較低的水平，有利于菌體攝取更多的營養促進生長，同時可激活酸性蛋白酶的活性，促進礦物質磷、鐵、鈣及維生素D的吸收，提高飼料利用率.張振威等［18］報道西門塔爾牛日糧中添加異丁酸后，有機物、粗蛋白的消化率以及日增重顯著高于對照組，肉牛干物質采食量顯著低于對照組，日糧添加異丁酸后對西門塔爾牛增重性能、營養物質消化和降低甲烷排放等都有顯著促進作用.

2.5 雙酶梭菌TK6產KIC的特性

雙酶梭菌產KIC的產量與底物L-亮氨酸、孵化時間有關（圖5）.當添加150，mmol/L的L-亮氨酸37，℃孵化4，h時，雙酶梭菌產KIC的產量最高為（8.18±0.06）mg/L.在動物生產中添加KIC增加蛋白質含量并促進家畜生長.Flakoll等［19］用瘤胃保護性α-酮異己酸鈣鹽飼喂閹牛和羔羊，發現動物日增量增多，提高了飼料轉化率.Kuhlman等［20］研究發現瘤胃保護性KIC的添加可增強羔羊淋巴細胞增殖反應以及抗豬紅細胞抗體反應.Nissen［21］還發現KIC對家畜乳脂的分泌具有促進作用.

圖5 雙酶梭菌TK6產KICFig. 5 Production of KIC using C. bifermentans TK6

3 結 論

雙酶梭菌TK6發酵不同功能性低聚糖，短鏈脂肪酸終產物主要是乙酸和丁酸，功能性低聚糖的種類對異丁酸的產量影響不顯著，相比于其他功能性低聚糖，TK6發酵IMOS產生相對最高的乙酸和丁酸，分別為（65.70±0.37）mmol/L和（53.51±0.52）mmol/L.當添加150，mmol/L的L-亮氨酸37，℃孵化4，h時，TK6產KIC量最高為（8.18±0.06）mg/L.菌株TK6分別利用IMOS、XOS、FOS時，其發酵液中纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶活力達到最高，為（1，994.84± 254.52）、（135.86±1.82）、（10.12±4.34）U/mL.雙酶梭菌TK6耐酸堿、耐高溫、耐受飼料的加工儲藏與胃的酸性環境等，在腸道內可萌發為有新陳代謝作用的益生細胞，其發酵液中含有較高活性的蛋白酶、纖維素酶，對植物碳水化合物有較強的降解能力，并能提高飼料轉化率，降低反芻動物的致病率，為工業化生產降低成本.雙酶梭菌可以作為反芻動物的候選益生菌，動物實驗有必要進一步驗證.

［1］ 王振華. 高產酶活芽胞桿菌篩選及對奶牛生產性能影響的研究［D］. 雅安：四川農業大學，2006.

［2］ Kozasa M. Toyocerin（Bacill us toyoi）as growth promotor for animal feeding［J］. Microbiologie Aliments Nutrition，1986，4（2）：121-135.

［3］ 朱曲波，秦澤榮，席振強，等. 在奶牛日糧中添加微生態制劑降低牛奶中體細胞的比較試驗［J］. 貴州畜牧獸醫，2004，28（2）：1-2.

［4］ Leja K，Myszka K，Olejnik-Schmidt A K，et al. Selection and characterization of Clostridium bifermentans strains from natural environment capable of producing 1，3-propanediol under microaerophilic conditions［J］. African Journal of Microbiology Research，2014，8（11）：1187-1197.

［5］ Gomez-Gil B，Roque A，Tumbull J F，et al. A review on the use of microorganisms as probiotics［J］. Revista Latinoamericana de Microbiología，1998，40（3/4）：166-172.

［6］ 楊晉輝，周凌云，趙蕓君，等. 反芻動物抗生素替代物的研究進展［J］. 中國畜牧獸醫，2011（7）：162-167.

［7］ 楊勝坤，潘康成，吳敏峰. 雙酶梭菌制劑對家兔生長和消化酶活性的影響［J］. 貴州農業科學，2009，37（8）：137-139.

［8］ Wang Haikuan，Shi Yan，Zhang Shuli，et al. The vitro fermentation of six functional oligosaccharides by Clostridium butyricum TK2 and Clostridium butyricum CB8［J］. Food Science and Technology International，2014，20（5）：1005-1011.

［9］ 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. GB/T 23527—2009蛋白酶制劑［S］. 北京：中國標準出版社，2009.

［10］ 王鍵. 利用分光光度法測定纖維素酶中Cx酶活力［J］.河南農業科學，2000（10）：31-32.

［11］ 劉德海，楊玉華，安明理，等. 纖維素酶酶活的測定方法［J］. 中國飼料，2002（17）：27-28.

［12］ Bailey M J，Biely P，Poutanen K. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity［J］. Journal of Biotechnology，1992，23（3）：257-270.

［13］ 祝玉洪. 不透明紅球菌生物合成α-酮異己酸的研究［D］. 無錫：江南大學，2010.

［14］ 布坎南 R E，吉本斯N E. 伯杰細菌鑒定手冊［M］. 9版. 北京：科學出版社，1995.

［15］ Nilsson U，Nyman M. Short-chain fatty acid formation in the hindgut of rats fed oligosaccharides varying in monomeric composition，degree of polymerisation and solubility［J］. British Journal of Nutrition，2005，94（5）：705-713.

［16］ 王中華. 反芻動物揮發性脂肪酸中間代謝［J］. 草食家畜，1995（2）：23-34.

［17］ Prohászka L，Jayarao B M，Fábián A，et al. The role of intestinal volatile fatty acids in the Salmonella shedding of pigs［J］. Journal of Veterinary Medicine Series B，1990，37（8）：570-574.

［18］ 張振威，王聰，劉強，等. 異丁酸對西門塔爾牛增重、日糧養分消化和甲烷排放的影響［J］. 草業學報，2014，23（1）：346-352.

［19］ Flakoll P J，Vandehaar M J，Kuhlman G，et al. Influence of alpha-ketoisocaproate on lamb growth，feed conversion，and carcass composition［J］. Journal of Anlmal Science，1991，69（4）：1461-1467.

［20］ Kuhlman G，Roth J A，Flakoll P J，et al. Effects of dietary leucine，alpha-ketoisocaproate and isovalerate on antibody production and lymphocyte blastogenesis in growing lambs［J］. Joumal of Nutrition，1988，118（12）：1564-1569.

［21］ Nissen S L. Method of feeding ketoisocaproate to lactating domestic mammals：U.S.，4758593［P］. 1988-07-19.

責任編輯：郎婧

Screening Clostridium bifermentans Strain TK6 and the Effect of Prebiotics on its Metabolic Activity

LI Jingjie，LIU Jinhui，WANG Haikuan
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Clostridium bifermentans TK6（C.bifermentans TK6）is a prebiotic of ruminant，whose fermentation products contain digestive enzyme，short chain fatty acid（SCFA）and α-ketoisocaproate（KIC）.It was screened from feces of healthy adults with the overlay method.Seven functional oligosaccharides，glucoseoligosaccharides（GLOS），fructooligosaccharides（FOS），galactooligosaccharides（GOS），xylooligosaccharides（XOS），isomaltoolig-osaccharides（IMOS），raffinose and stachyose，as the sole carbon source，were fermented respectively by C.bifermentans TK6 and contrasted. And then，the prebiotic content of each fermention product including SCFA，isobutyrate，KIC and hydrolase was checked.The results showed that each type of oligosaccharides as a sole carbon source has different effects on the growth of TK6 and the yield of hydrolase and SCFA.There is a significant increase of TK6 in IMOS，and the viable count is（7.97±0.16）×108mL-1.The production of acetate and butyrate reached（65.70±0.37）mmol/L and （53.51±0.52）mmol/L，respectively.Moreover，the cellulase activity reached（1，994.84±254.52）U/mL.Fermentation of XOS by TK6 resulted in the highest xylanase activity（135.86±1.82）U/mL，and the highest protease activity using FOS was（10.12±4.34）U/mL.The highest production of KIC was（8.18±0.06）mg/L while adding 150 mmol/L L-leucine and hatched 4 h at 37 ℃.

Clostridium bifermentans；functional oligosaccharides；short chain fatty acids（SCFA）；hydrolases

Q93

A

1672-6510（2016）03-0031-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150100

2015-08-05；

2015-12-31

李敬杰（1990—），女，天津人，碩士研究生；通信作者：王海寬，教授，hkwang@tust.edu.cn.