pH區帶逆流色譜法分離純化丹參中的丹酚酸B和迷迭香酸

李懷志，宮成玉，李云，楊鵬，李佳，王曉

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南250355； 2. 煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000； 3. 濟南三峰生物工程有限責任公司，山東 濟南 250014； 4. 山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

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pH區帶逆流色譜法分離純化丹參中的丹酚酸B和迷迭香酸

李懷志1, 4，宮成玉2，李云1, 4，楊鵬3，李佳1，王曉4*

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南250355； 2. 煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000； 3. 濟南三峰生物工程有限責任公司，山東 濟南 250014； 4. 山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

摘要：采用pH區帶精制逆流色譜技術(pH-ZRCCC)快速分離純化丹參中的丹酚酸B和迷迭香酸。以乙酸乙酯-水(1∶1, V/V)為溶劑體系，上相加入三氟乙酸，使濃度達到10 mmol/L，作為固定相；下相加入氨水使濃度達到20 mmol/L，作為流動相；設置主機轉速為850 r/min，流速為2.0 mL/min，檢測波長為280 nm，對樣品進行分離制備。從500 mg丹參粗提物中一次分離得到386 mg丹酚酸B以及25 mg迷迭香酸，經HPLC分析純度分別為96.3%和98.1%，各化合物通過電噴霧電離(ESI)譜和1H-NMR進行了化學結構鑒定。研究結果表明，pH-ZRCCC是一種快速、高效分離純化丹酚酸B和迷迭香酸的方法。

關鍵詞：pH區帶逆流色譜；丹酚酸B；迷迭香酸

丹參藥材來源于唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根和根莖，是臨床常用中藥，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩以及涼血消癰等功效[1]。丹酚酸B是丹參水溶性物質中的主要成分，在丹參酚酸類成分中含量最高。現代藥理研究證實，丹酚酸B具有抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集、抑制神經細胞凋亡、預防心腦血管疾病、抗動脈粥樣硬化以及抗肝損傷等活性[2-4]。迷迭香酸是丹參水溶性成分之一，是天然的抗氧化劑，有免疫調節、抗炎、抗菌和抗病毒等多種活性[5-6]。

傳統柱色譜對丹酚酸B和迷迭香酸的分離純化存在耗時長、易導致樣品的變性和回收率低等缺點，無法滿足高效快速制備純品的需求。pH區帶精制逆流色譜技術(pH-zone-refining counter-current chromatography, pH-ZRCCC)作為一種新型制備分離技術，基于高速逆流色譜發展起來。其利用待分離有機酸(堿)的酸(堿)解離常數及疏水性的不同進行分離，通過添加保留酸(或堿)到溶劑體系的固定相中，同時洗脫堿(或酸)被加入到流動相中，使得不同的物質被逐個洗脫出來，其洗脫過程中伴隨著pH值的改變，色譜圖形成按pH值的大小排列邊界陡峭的矩形平臺峰，平臺區內的產物高度濃縮，而平臺峰的兩側是被濃縮的雜質。相比傳統的逆流色譜分離，在保留其分離純度和分離效率高等優點的基礎上，具有更大的樣品分離量，現已被廣泛用于天然產物有效成分的分離[7-11]。

目前，pH-ZRCCC已經用于丹酚酸B的分離制備[12]，具有分離速度快和進樣量大等優點，但是所得的丹酚酸B和迷迭香酸的純度不夠高。本實驗根據丹酚酸B的極性較大的特點，選用乙酸乙酯-水體系，為丹酚酸B和迷迭香酸(結構見圖1)的分離制備提供一種更簡便高效、分離純度更高的方法。

圖1　丹酚酸B和迷迭香酸的化學結構Fig.1　Chemical structures of salvianolic acid B and rosmarinic acid

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

TBE300A高速逆流色譜儀(上海同田生化技術有限公司)，包括TBP5002泵、8823B紫外檢測儀、3057-11便攜式記錄儀；Waters 600-996高效液相色譜系統(二極管陣列PDA檢測器，美國Waters公司)；高速中藥粉碎機(瑞安市百信藥機器械廠)；Varian INOVA-400 Hz型核磁共振波譜儀 (美國Varian公司)；GF254硅膠板(青島海洋化工廠)。

高效液相色譜所用乙腈為色譜純(美國天地公司)，水為過濾蒸餾水；大孔樹脂(D101)和pH-ZRCCC分離用溶劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)，所用水為去離子水。

干燥的丹參根購自于萊蕪紫光生態園有限公司，由山東中醫藥大學李佳教授鑒定，確定是唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.。

1.2樣品制備

取干燥的丹參150 g，粉碎，加300 mL二氯甲烷浸泡過夜，過濾，得丹參殘渣，晾干。以65%乙醇回流提取兩次，每次1.5 h，過濾。合并兩次濾液，減壓濃縮，濃縮液以2 mol/L鹽酸調pH值至2.08，冷藏沉降過夜。取上清液過大孔樹脂柱(m=165 g,V=232 mL)，出液淺色渾濁，以水洗滌至洗出液變清，再以50%的乙醇洗脫，以三氯化鐵溶液監測，并接收丹酚酸B組分，減壓蒸干，得6.4 g丹參提取物，冷藏保存備用。

1.3兩相溶劑體系和樣品溶液的制備

pH-ZRCCC的溶劑系統為乙酸乙酯-水(1∶1,V/V)按比例置于分液漏斗中，震蕩后充分靜置使其分層。取上相加10 mmol/L的三氟乙酸，下相加20 mmol/L的氨水，超聲脫氣15 min備用。

取500 mg的丹參粗提物，用6 mL加了三氟乙酸的上相和6 mL未加氨水的下相溶解，作為樣品溶液。

1.4pH區帶逆流色譜分離過程

首先以20 mL/min的速度將已經脫氣的固定相泵入HSCCC分離管，待整個分離管被固定相充滿后，開啟主機，緩慢調節速度控制器至850 r/min (正轉)，此時，由進樣閥注入樣品溶液，同時以2.0 mL/min的速度泵入流動相，并打開檢測器和記錄儀開始采集數據，于280 nm下檢測流出物，根據色譜圖，每10 mL為一管收集流出物，同時用pH計檢測每管的pH值。

1.5HPLC分析

用高效液相色譜法分析丹參粗提物和pH-ZRCCC分離所得的各化合物。色譜柱為Waters Symmetry RP18柱(250 mm×4.6 mm I.D., 5 μm)；檢測波長280 nm；流動相為乙腈-水(0.026%磷酸) (30∶70,V/V)等度洗脫；流速為1.0 mL/min；進樣體積20 μL。

2結果與討論

2.1HPLC條件優化

最優高效液相色譜條件旨在最短的分析時間內相鄰的兩個峰有很好的分離度，考察以甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.02%乙酸水溶液和乙腈-0.03%磷酸水溶液作為HPLC流動相時丹參粗提物中各組分的分離效果。結果表明，當采用乙腈-0.03%磷酸水溶液體系等度洗脫(30∶70,V/V)，流速設定為1.0 mL/min時，各成分能夠實現基線分離，并檢測到粗提物中丹酚酸B的純度(峰面積比)為82%，分析結果見圖2a。利用優化好的液相條件對分離的各組分進行檢測，純度分別為96.3%和98.1%，分析結果見圖2b和圖2c。

圖2　丹參粗提物和pH-區帶逆流色譜分離組分的HPLC分析圖Fig.2　HPLC chromatogram of crude extract from Salvia miltiorrhiza Bge. and separated fractions by pH-ZRCCC

2.2pH區帶逆流色譜分離條件優化

在pH區帶逆流色譜中，選擇合適的兩相溶劑系統是成功分離純化天然植物中活性成分的關鍵。本實驗根據酚酸類化合物的極性，選擇了乙酸乙酯-水(1∶1,V/V)溶劑系統，并考察了該溶劑系統在不同堿度流動相時，各化合物的分離情況，結果發現在上相添加10 mmol/L三氟乙酸，下相添加10 mmol/L氨水的溶劑系統時，雖然實現了丹酚酸B和迷迭香酸的分離，但是所需要的洗脫時間太長 (見圖3a)。為了縮短分離時間，加快洗脫速度，我們嘗試將流動相的氨水濃度調高到15 mmol/L，測試后發現洗脫時間有一定程度的縮短，我們繼續增加氨水的濃度到20 mmol/L時，時間被大幅度縮短，并且不影響分離組分的純度。取丹參粗提物500 mg，采用乙酸乙酯-水(1∶1,V/V)，上相添加10 mmol/L三氟乙酸，下相添加20 mmol/L氨水溶劑系統進行分離，丹酚酸B和迷迭香酸以不規則的矩形峰形式被洗脫出來，在102～235 min得到化合物1丹酚酸B 389 mg， 252～268 min得到化合物2迷迭香酸25 mg，雜質和次要成分集中在矩形峰的兩側，固定相保留率為43%，分離效果見圖3b。

圖3　丹參粗提物的pH-ZRCCC色譜圖Fig.3　pH-ZRCCC chromatogram of crude extract from Salvia miltiorrhiza Bge.

2.3分離化合物的結構鑒定

化合物1，類白色粉末，ESI-MS,m/z719 [M+H]+;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ: 6.88 (1H, d,J=8.7 Hz, C5-H), 7.20 (1H, d,J= 8.4 Hz, C6-H), 7.42 (1H, d,J= 16.2 Hz, C7-H), 6.21 (1H, d,J= 16.3 Hz, C8-H), 6.55～6.61 (1H, m, C6′-H), 6.77 (1H, d,J= 3.6 Hz, C5′-H), 6.79 (1H, d,J= 1.9 Hz, C2′-H), 5.93 (1H, d,J= 4.6 Hz, C7′-H), 6.74 (1H, d,J= 2.6 Hz, C2″-H), 6.70 (1H, d,J= 8.7 Hz, C5″-H), 4.29 (1H, d,J= 4.7 Hz, C8″-H), 2.80 (1H, dd,J= 9.6, 14.3 Hz, C7″a-H),3.01(2H, dd,J= 4.5, 14.3 Hz, C7″b-H, C7?a-H), 3.09 (1H, dd,J= 4.1, 14.3 Hz, C7?b-H), 5.23 (2H, dd,J= 5.8, 12.9 Hz, C8″-H, C8?-H), 6.26～6.33 (1H, m, C6?-H), 6.56 (1H, d,J= 8.0 Hz, C5?-H), 6.54 (1H, d,J= 1.9 Hz, C2?-H), 6.66 (1H, dd,J= 2.1, 8.2 Hz, C6″-H)。以上數據和文獻[13]報道一致，并且樣品色譜保留時間與丹酚酸B對照品一致，由此確定化合物1是丹酚酸B。

化合物2，白色粉末，ESI-MS,m/z361 [M+H]+;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ: 6.30 (1H, d,J= 15.6 Hz, C8-H), 6.89 (1H, dd,J= 1.8, 8.7 Hz, C5-H), 7.09 (1H, d,J= 1.8 Hz, C2-H), 7.66 (1H, d,J=15.6 Hz, C7-H), 2.93～3.09 (2H, m, C7′-H), 5.12 (1H, s, C8′-H), 6.60 (1H, d,J= 8.1 Hz, C6′-H), 6.69 (1H, d,J=7.9 Hz, C5′-H), 6.77～6.89 (2H, m, C6-H, C2′-H)。以上數據和文獻報道一致，并且樣品色譜保留時間與迷迭香酸對照品一致，由此確定化合物2是迷迭香酸。

3結論

pH-ZRCCC在普通逆流色譜儀器的基礎上，以化合物不同的解離常數(Ka)和疏水性來實現制備分離，并且在分離制備有機酸和生物堿等化合物方面具有獨特的優勢。本文報道應用pH-ZRCCC從丹參中分離丹酚酸B和迷迭香酸，通過增加流動相洗脫堿的濃度來加快洗脫速度，從而實現了pH區帶逆流色譜對丹酚酸B和迷迭香酸的快速分離，該法簡單易行，省時省力，并且純化效果明顯，具有較好的實際應用價值。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.03.003

收稿日期：2016-02-22

基金項目：山東省科技發展計劃(2014GZX219003)

作者簡介：李懷志(1991-)，女，碩士研究生，研究方向為天然產物與純化。 *通信作者，王曉(1971-)，男，研究員。Email: wangx@sdas.org

中圖分類號：R284.2

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026(2016)03-0013-05

Separation and purification of salvianolic acid B and rosmarinic acid fromSalviamiltiorrhizaBge. by pH-zone-refining counter-current chromatography

LI Huai-zhi1, 4，GONG Cheng-yu2, LI Yun1, 4, YANG Peng3, LI Jia1，WANG Xiao4*

( 1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. Yantai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China; 3. Sanfeng Biological Engineering Technology Co. Ltd.,Jinan 250014, China; 4. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China)

Abstract∶We rapidly separated and purified salvianolic acid B and rosmarinic acid from Salvia miltiorrhiza Bge.by pH-zone-refining counter-current chromatography (pH-ZRCCC). The extraction conditions included solvent system of ethyl acetate-water (1∶1, V/V), upper stationary phase of 10 mmol/L trifluoroacetic acid, lower mobile phase of 20 mmol/L NH3H2O, rotation speed of 850 r/min, flow speed of 2.0 mL/min, and detection wavelength of 280 nm. Salvianolic acid B of 386 mg and rosmarinic acid of 25 mg were extracted from crude extract of 500 mg, whose purities were 96.3% and 98.1% through HPLC analysis. Their compound structures were identified by ESI-MS and1H-NMR. Experimental results show that pH-ZRCCC is a rapid and efficient method to separate and purify salvianolic acid B and rosmarinic acid.

Key words∶ pH-zone-refining counter-current chromatography; salvianolic acid B; rosmarinic acid

【中藥與天然活性產物】