依西美坦聯(lián)合同期或序貫放射對MCF-7細(xì)胞放射敏感性的影響

陳　剛，金冶寧，張順康，王　鑫.上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院放療科，上海　0000；.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院放療科，上海　0005

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依西美坦聯(lián)合同期或序貫放射對MCF-7細(xì)胞放射敏感性的影響

陳剛1，金冶寧2，張順康1，王鑫1
1.上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院放療科，上海200002；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院放療科，上海200025

［摘要］背景與目的：放療和內(nèi)分泌治療是乳腺癌術(shù)后輔助治療的重要組成部分，但關(guān)于二者相互作用的研究較少。輔助放療和內(nèi)分泌治療的最佳時(shí)序至今尚無定論，而兩者的時(shí)序安排對臨床卻非常重要。本研究通過探討依西美坦同期或序貫放射對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株放射敏感性的影響及其可能的機(jī)制，為臨床制定最佳的治療模式提供理論依據(jù)。方法：將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株分成單純放射組、放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組，采用克隆形成試驗(yàn)法檢測各組的放射敏感性，用MTT法檢測各組的細(xì)胞增殖率，用DAPI染色法檢測各組的細(xì)胞凋亡率，用蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測各組Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組的放射增敏比（sensitive enhancement ratio，SER）分別為1.51和1.37；與單純放射組相比，依西美坦聯(lián)合放射組腫瘤細(xì)胞抑制率和細(xì)胞凋亡率均明顯升高；依西美坦聯(lián)合放射組能明顯使Bax蛋白升高，Bcl-2蛋白降低，但放射與依西美坦的使用順序差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：依西美坦對MCF-7細(xì)胞具有放射增敏作用，可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，放射與依西美坦的使用順序?qū)πЧ麩o影響。

［關(guān)鍵詞］依西美坦；MCF-7細(xì)胞；放射敏感性

乳腺癌的綜合治療包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等，作為術(shù)后輔助治療的重要手段，放療屬于局部治療，而化療與內(nèi)分泌治療同屬全身治療范疇。目前認(rèn)為，輔助化療與放療、內(nèi)分泌治療聯(lián)合時(shí)應(yīng)先化療再序貫放療和內(nèi)分泌治療［1-3］。但輔助放療和內(nèi)分泌治療的時(shí)序性研究至今尚無定論。依西美坦作為第三代芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitors，AI），能提高絕經(jīng)后受體陽性高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者的無病生存率，不良反應(yīng)低，成為這部分患者的一線治療用藥［4-5］。本研究通過觀察依西美坦聯(lián)合同期或序貫放射對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞放射敏感性的影響，為臨床制定最佳的治療模式提供一定的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料和試劑

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；染色劑噻唑藍(lán)（MTT）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；依西美坦購自美國Selleckchem公司，溶解在二甲基亞砜中，半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）為30μmol/L；抗Bcl-2（ab117115）、抗Bax（ab7997）和抗β-actin（ab6276）抗體購自英國Abcam公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

將MCF-7細(xì)胞分為單純放射組、依西美坦組、放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組。放射前加依西美坦組在放射前1天加入20μmol/L依西美坦，放射后加依西美坦組在放射后24h加入20μmol/L依西美坦。

1.4照射方法

采用美國Varian公司Clinac ix直線加速器。照射條件：6MV X線，劑量率為300cGy/min，源皮距100cm，照射野大小為20cm×20cm，加1cm等效補(bǔ)償膜。

1.5克隆形成實(shí)驗(yàn)

取指數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按照射劑量0、2、4、6和8Gy分別在96孔中接種200、200、400、600和800個(gè)細(xì)胞，每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行樣本，按上述方法分為放射組、放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組，照射后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)14d，待出現(xiàn)集落時(shí)終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，用calceinAM染色10min，計(jì)數(shù)細(xì)胞大于50個(gè)以上的集落數(shù)，計(jì)算存活分?jǐn)?shù)繪制劑量效應(yīng)曲線。克隆率（plating efficiency，PE）=對照組每孔克隆數(shù)/每孔種植細(xì)胞數(shù)×100%，并以PE作為校正系數(shù)計(jì)算存活分?jǐn)?shù)（surviving fraction，SF）。SF=實(shí)驗(yàn)組每組克隆數(shù)/（每孔細(xì)胞種植數(shù)×克隆率）。數(shù)據(jù)分析使用GraphPade Prism5.0軟件，以單靶多擊擬合細(xì)胞存活曲線，并計(jì)算平均致死劑量（mean lethal dose，Do）、準(zhǔn)閾劑量（quasithreshold，Dq），SF2值和放射增敏比（sensitive enhancement ratio，SER）。

1.6MTT法檢測細(xì)胞增殖情況

采用MTT法檢測依西美坦對MCF-7細(xì)胞增殖情況。將指數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，按上述實(shí)驗(yàn)分組方法分為放射組、放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組，同時(shí)加細(xì)胞組不作處理作為對照組以及空白組。照射方法為單次照射4Gy，培養(yǎng)6d后進(jìn)行檢測。每組設(shè)立4個(gè)復(fù)孔，每孔加入20μL MTT（以磷酸緩沖鹽溶液PBS配成5mg/mL），37℃溫育4h后，每孔加二甲基亞砜100μL，在酶聯(lián)免疫檢測儀上以490nm波長測定各孔吸光度（D）值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。抑制率=（1-D實(shí)驗(yàn)組）/ D對照組×100%。

1.7DAPI染色法檢測細(xì)胞凋亡情況

將指數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞按上述方法分4個(gè)處理，設(shè)立空白對照。照射方法為單次照射4Gy，藥物濃度為20μmol/L。培養(yǎng)10d后進(jìn)行細(xì)胞檢測，檢測時(shí)PBS洗3遍，加DAPI熒光染色劑（質(zhì)量濃度為10μg/mL）反應(yīng)30min，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核凋亡情況，并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.8蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測Bcl-2 和Bax蛋白表達(dá)情況

將指數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞以每孔6×106個(gè)細(xì)胞接種于10mm培養(yǎng)皿，按上述實(shí)驗(yàn)分組分為依西美坦組、放射組、放射前加依西美坦組和放射后加依西美坦組，照射方法為單次照射4Gy，藥物濃度為20μmol/L。培養(yǎng)10d后刮取細(xì)胞用于檢測。首先用BAC對蛋白進(jìn)行定量。用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，凝膠上的蛋白帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1h，然后加入一抗（抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗β-actin1︰5000）4℃溫育過夜，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。用FluorChem軟件（美國CB公司）掃描分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0軟件分析，數(shù)據(jù)用±s 表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1依西美坦增強(qiáng)放射敏感性

根據(jù)各組克隆數(shù)得出克隆形成率和存活分?jǐn)?shù)，運(yùn)用單擊多靶模型進(jìn)行曲線擬合（圖1），并得出放射學(xué)參數(shù)（表1）。結(jié)果表明，依西美坦具有放射增敏作用，放射前或放射后加入的放射增敏比分別為1.51和1.37，放射前加入放射敏感性更強(qiáng)。

2.2依西美坦聯(lián)合放射明顯抑制細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，單純依西美坦雖然可以抑制MCF-7細(xì)胞增殖，跟對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.809，P=0.1447），而單純放療能明顯抑制細(xì)胞增殖（t=3.127，P=0.0353），兩者聯(lián)合能明顯加強(qiáng)細(xì)胞生長抑制的程度（t=6.875， P=0.0023；t=7.486，P=0.0017），但同期組和序貫組對細(xì)胞的抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.019，P=0.1136，圖2）。

圖1　MCF-7細(xì)胞經(jīng)不同處理后的細(xì)胞存活曲線Fig.1　Survival curves of MCF-7 cells after different treatment modalities

表1　MCF-7細(xì)胞經(jīng)不同處理后的放射生物學(xué)參數(shù)Tab.1　Radio-biological parameters of MCF-7 cells after different treatment modalities

圖2　MCF-7細(xì)胞經(jīng)不同處理后的細(xì)胞生長抑制率曲線Fig.2　Growth-inhibition rate curves of MCF-7 cells after different treatment modalities

2.3依西美坦聯(lián)合放射促進(jìn)細(xì)胞凋亡

用DAPI染色法觀察并計(jì)算細(xì)胞核凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，單純依西美坦對細(xì)胞凋亡影響不顯著（t=2.00，P=0.1161），而單純放射能促進(jìn)細(xì)胞凋亡（t=9.400，P=0.0007），依西美坦聯(lián)合放射能進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡（t=19.00，P＜0.0001），但同期組和序貫組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.6325，P=0.5614，圖3、4）。

圖3　DAPI染色法熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞核凋亡Fig.3　Fluorescence and electron microscopic observation of nucleus apoptosis in each group of cells with DAPI stain method

圖4　MCF-7細(xì)胞經(jīng)不同處理后細(xì)胞凋亡情況Fig.4　Apoptosis of MCF-7 cells after different treatment modalities

2.4依西美坦聯(lián)合放療促進(jìn)Bcl-2降低和Bax升高

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Bcl-2抗凋亡指數(shù)各組都有降低（t值分別為15.02、12.94、14.60和17.56，P值分別為0.0001、0.0002、0.0001和0.0001），但同期組和序貫組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.436，P=0.2244）；處理組對Bax的表達(dá)均有影響（與對照組比較，t值分別為4.276、3.865、7.171和8.357，P值分別為0.0129、0.0181、0.0020和0.0011），均能使Bax升高，但同期組和序貫組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.290，P=0.2666，圖5）。

圖5　MCF-7細(xì)胞經(jīng)不同處理后Bcl-2、Bax表達(dá)情況Fig.5　Expressions of Bcl-2 and Bax in MCF-7 cells after different treatment modalities

3　討　論

乳腺癌內(nèi)分泌治療目前應(yīng)用于臨床安全有效的藥物以三苯氧胺（tamoxifen，TAM）和第三代AI為代表［6］。

以阿那曲唑、來曲唑和依西美坦為代表的第三代AI的出現(xiàn)是乳腺癌內(nèi)分泌治療史上的一個(gè)轉(zhuǎn)機(jī)，目前有多個(gè)大型臨床試驗(yàn)均顯示其具有比TAM更好的療效［7-8］。ATAC試驗(yàn)的10年隨訪結(jié)果顯示，阿那曲唑組的無病生存期、無病生存率、復(fù)發(fā)時(shí)間及復(fù)發(fā)率均優(yōu)于TAM組，且對側(cè)乳腺癌的發(fā)生率顯著降低；但是兩組的總生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［9］。BIGl-98試驗(yàn)中位隨訪時(shí)間為74個(gè)月，其研究結(jié)果顯示，來曲唑組較TAM組能顯著改善患者的無病生存期，顯著降低絕經(jīng)后激素受體陽性乳腺癌患者的死亡和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［10］。IES試驗(yàn)中位隨訪時(shí)間為91個(gè)月，該研究結(jié)果顯示，與5年TAM組比較，TAM治療2～3年后改為依西美坦治療2～3年組的無病生存期及總生存期有顯著提高［11］。因此，在乳腺癌內(nèi)分泌治療上，無論起始治療、序貫或轉(zhuǎn)換治療還是后期延續(xù)治療，第三代AI對于絕經(jīng)后激素受體陽性的乳腺癌患者在長期療效和安全性方面更具有優(yōu)勢［12-15］。

由于第三代AI上市時(shí)間短，國內(nèi)外為數(shù)不多的研究主要集中于來曲唑與放療的相互作用［16-18］。

同是第三代AI，但依西美坦和來曲唑作用機(jī)制不同，來曲唑?yàn)榉晴摅w類的AI，主要作用于芳香化酶的細(xì)胞色素P450酶，其作用是可逆的；而依西美坦為甾體類芳香化酶致死性抑制劑，它結(jié)構(gòu)上與該酶的自然底物雄烯二酮和睪酮結(jié)構(gòu)相似，為芳香酶的偽底物，通過不可逆地與該酶的活性位點(diǎn)結(jié)合而使其失活，形成中間產(chǎn)物而引起永久性的酶滅活，從而抑制雌激素的合成，明顯降低絕經(jīng)婦女血液循環(huán)中的雌激素水平［19-20］，而且不影響可的松和醛固酮的合成。但依西美坦與放療的相互作用情況目前尚缺乏相關(guān)的研究。

本研究的成克隆試驗(yàn)結(jié)果顯示，無論放射前或放射后聯(lián)合依西美坦處理MCF-7細(xì)胞，依西美坦均具有放射增敏作用，MTT結(jié)果也進(jìn)一步說明兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)細(xì)胞生長明顯受到抑制。本研究還發(fā)現(xiàn)，依西美坦放射增敏機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。因?yàn)橥ㄟ^DAPI染色法觀察細(xì)胞核固縮情況，結(jié)果顯示，單純依西美坦對細(xì)胞凋亡影響不明顯，但聯(lián)合放射能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而且使抗凋亡指數(shù)Bcl-2降低和促凋亡指數(shù)Bax升高，能進(jìn)一步增加放射誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用［21］。

但實(shí)驗(yàn)室研究與臨床研究結(jié)論往往存在不一致性。本研究結(jié)果顯示，依西美坦聯(lián)合同期或序貫放射均能提高人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的放射敏感性，其具有放射增敏作用。同期依西美坦是否會(huì)導(dǎo)致增加患者放療的不良反應(yīng)，另一方面，延遲依西美坦的起始時(shí)間是否會(huì)影響療效，或在放射治療預(yù)防局部復(fù)發(fā)的同時(shí)是否會(huì)失去全身治療的保障，這些問題仍需我們進(jìn)一步開展前瞻性臨床隨機(jī)對照研究來探討乳腺癌術(shù)后放療聯(lián)合AI內(nèi)分泌治療的時(shí)序性，尋找最佳治療模式來指導(dǎo)臨床實(shí)踐，使患者獲得更好的生存受益。

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DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.05.017

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639（2016）05-0452-06

收稿日期：（2015-10-09修回日期：2015-12-30）

基金項(xiàng)目：上海市黃浦區(qū)衛(wèi)計(jì)委優(yōu)秀學(xué)科帶頭人培養(yǎng)項(xiàng)目課題［（2013）HWR/D-10］。通信作者：陳剛E-mail：fodeng73@163.com

Effect of concurrent or sequential exemestane combined with radiation on radiosensitivity of MCF-7cells

CHEN Gang1， JIN Yening2， ZHANG Shunkang1， WANG Xin1
（1. Department of Radiation Oncology，Huangpu District Central Hospital， Shanghai 200002， China； 2. Department of Radiotherapy， Ruijin Hospital， Shanghai Jiao Tong University， School of Medicine， Shanghai 200025， China）Correspondence to： CHEN Gang E-mail： fodeng73@163.com

［Abstract］Background and purpose： Radiotherapy and endocrine therapy are both important parts of adjuvant therapy for breast cancer， yet few studies have been conducted focusing on the interaction between radiation and endocrine therapy. Up to now， no conclusion has been drawn on the timing sequence of adjuvant radiation and endocrine therapy， which is indeed crucial in clinical practice. This study intended primarily to investigate the effect of concurrent or sequential exemestane combined with radiation on radiosensitivity of MCF-7 cells and its possible mechanism， and further to provide rationale for optimal clinical treatment modality. Methods： MCF-7 cells were arranged into three trial groups： the radiation group， exemestane sequenced with radiation group and exemestane followed radiation group. Radiosensitivity was evaluated by clonogenic assay， cell proliferation was measured by MTT assay， the ability to induce cell apoptosis was evaluated by DAPI staining assay， the changes of Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. Results： Sensitive enhancement ratios （SER） were 1.51 and 1.37 in the exemestane sequenced with radiation group and exemestane followed radiation group， respectively. Compared with the radiation group， the percentage of cellular proliferation inhibition and apoptosis increased obviously in the exemestane sequenced with radiation group and exemestane followed radiation group. Exemestane combined with radiation made the Bax protein increase obviously and the Bcl-2 protein lowered significantly. Conclusion： Exemestane can enhance the radiosensitivity of MCF-7 cells， whose mechanism might be relevant to the promotion of cellular apoptosis. However，the treatment sequence does not affect the outcome.

［Key words］Exemestane； MCF-7 cell； Radiosensitivity