Claudin-1胞外片段Cldn-153～80的作用在乳腺癌轉移機制中的研究*

彭亞琪， 蔡瑜嬌，江恩來，孫立華

(第三軍醫大學新橋醫院普通外科，重慶 400037)

Claudin-1胞外片段Cldn-153～80的作用在乳腺癌轉移機制中的研究*

彭亞琪， 蔡瑜嬌△，江恩來，孫立華

(第三軍醫大學新橋醫院普通外科，重慶 400037)

目的 觀察Claudin-1在乳腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系，探討Claudin-1的胞外區Cldn-153～80片段在乳腺癌轉移中的作用機制。方法 (1)應用免疫組織化學技術檢測108例乳腺癌標本中 Claudin-1的表達情況，并分析其與乳腺癌淋巴結轉移、TNM 分期和分子分型間的關系；(2)在乳腺癌細胞株中摻入Cldn-153～80片段，應用Western blot技術檢測緊密連接蛋白Claudin-1、Claudin-2的表達。結果 (1)以是否淋巴結轉移、臨床分期、分子分型等病理特征為依據分組中，Claudin-1的表達強度在淋巴結轉移組(χ2=6.279，P=0.012)、TNM分期Ⅲ、Ⅳ期(χ2=7.419，P=0.024)及分子分型為Her-2過表達型(χ2=10.830，P=0.013)組中顯著降低，差異有統計學意義；(2) Cldn-153～80片段的摻入可導致乳腺癌細胞中緊密連接蛋白Claudin-1及Claudin-2的表達下降，在轉移性高的乳腺癌細胞株MDA-MB-231中，這種抑制作用更為顯著。結論 緊密連接蛋白 Claudin-1的表達降低與乳腺癌的進展和轉移密切相關，而Cldn-153～80片段通過調控緊密連接蛋白的表達在乳腺癌細胞侵襲、轉移過程中發揮重要作用。

乳腺腫瘤；淋巴轉移；Claudin-1；轉移機制；胞外片段；Cldn-153～80

乳腺癌的發病率在女性癌癥譜中位居首位，作為影響女性生存期及生存質量的主要疾病已被人們所共識。在乳腺癌的診療中，控制疾病的遠處轉移被認為是影響患者生存期及生存質量的關鍵。緊密連接是上皮細胞間連接的主要形式，它的結構與功能的破壞與乳腺癌的轉移息息相關。在正常乳腺組織中，Claudins蛋白家族參與構成了上皮細胞間的緊密連接，維持細胞極性、黏附性，控制細胞的增殖及遷移[1-2]。而在乳腺發生癌轉移的過程中，緊密連接的結構與功能顯著破壞，導致細胞極性、黏附性破壞，細胞的增殖及遷移能力增強[2]，有利于乳腺癌細胞的侵襲和轉移。其中，Claudin-1蛋白在維持上皮細胞緊密連接的結構和功能中至關重要[3]。本研究收集了臨床乳腺癌標本108例，通過觀察乳腺癌組織中Claudin-1的表達與病理特征的關系，探討其胞外區Cldn-153～80片段在乳腺癌轉移中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2013年9月至2015年12月乳腺癌手術的大體標本108例，術后均病理證實為浸潤性乳腺癌。標本均為女性，年齡27～74歲。分別為浸潤性導管癌98例，浸潤性小葉癌5例，髓樣癌1例，小管癌2例，腺樣囊性癌1例，黏液腺癌1例。根據乳腺癌分子分型，管腔上皮A(Luminal A)型24例，管腔上皮B(Luminal B)型45例，Her-2過表達型14例，三陰型25例。根據TNM分期，Ⅰ期13例，Ⅱ期62例，Ⅲ期32例，Ⅳ期1例。其中，有淋巴結轉移59例，無淋巴結轉移49例。所有患者均未行術前放療、化療及內分泌治療。標本均經10%中性福爾馬林溶液處理后包埋固定。人類乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7由第三軍醫大學第二附屬醫院普通外科實驗室提供。

1.2 主要試劑與儀器 Claudin-1 抗體(Abcam公司1∶1 000)。Claudin-2 抗體(Abcam公司1∶500)。Cldn-153～80(Ac-SCVSQSTGQIQCKV-Phe-DSLLNLSSTLQAT-NH2)由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標本收集 收集108例臨床乳腺癌大體標本并作數據分析，以年齡、是否淋巴結轉移、TNM分期、分子分型等特征分組。

1.3.2 免疫組織化學 將臨床乳腺癌病理組織石蠟包埋，作4 μm切片，60 ℃下拷片1 h，脫蠟及復水；過氧化氫清除內源性過氧化物酶活性；微波抗原修復；山羊血清蛋白阻斷非特異性染色；滴加一抗(4 ℃，過夜)；滴加二抗(37 ℃，20 min)；滴加鏈霉素親和素-生物素并進行親和孵育(37 ℃，30 min)；DAB顯色。用PBS液作陰性對照。結果評定：無背景著色情況下，細胞出現黃色顆粒者為陽性。計算高倍鏡下(×400)陽性細胞百分數并賦予分值：≤ 5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。觀察著色強度并賦予分值：無著色為0分；著淺黃色為1分；著黃色為2分；著棕黃色為3分。兩者相乘：0分為(-)；1～4分為(+)；5～8分為(++)；9～12分為(+++)。每張切片由兩名高年資病理科醫師進行獨立評分后取平均值作為該病例最終評分：將評分(-)～(+)設為低表達；評分(++)～(+++)設為高表達。

1.3.3 摻入Cldn-153～80片段 將MDA-MB-231、MCF-7細胞株進行細胞培養，加入200 μmol/L濃度的Cldn-153～80小肽段，24 h， 4 ℃下孵育過夜；平衡鹽溶液、BS3交聯液洗滌，室溫孵育1 h；提取全細胞的總蛋白。

1.3.4 Western blot 取等量樣品上樣并進行電泳及轉膜；室溫下封閉1 h，切膜;加入相應抗體，Claudin-1(小鼠 1∶1 000)，Claudin-2(小鼠 1∶5 000)，β-actin(小鼠 1∶5 000)購自Abcam公司;4 ℃下孵育過夜，然后1×TBST漂洗3次，每次10 min，加入二抗(Claudin-1抗鼠1∶3 000、Claudin-2抗鼠1∶3 000、actin抗鼠 1∶10 000)，室溫下搖床孵育 2 h，用1×TBST漂洗3遍，每次30 min；經 BioRad顯影，通過凝膠分析系統分析蛋白的表達。

1.4 統計學處理 所有統計處理在SPSS 13.0軟件上完成。計數資料用χ2檢驗，實驗結果差異分析采用Studentt-test。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 乳腺癌中Claudin-1的表達強度與病理特征的關系 乳腺癌中有淋巴結轉移組的Claudin-1表達強度弱于無淋巴轉移組(χ2=6.279，P=0.012)。乳腺癌TNM分期中，Ⅰ期和Ⅱ期組之間的Claudin-1表達強度差異無統計學意義，Ⅲ期及Ⅳ期的Claudin-1表達強度明顯弱于前者，差異有統計學意義(χ2=7.419，P=0.024)。在乳腺癌不同的分子分型中，僅Her-2過表達型的Claudin-1的表達強度弱于其他3組，差異有統計學意義(χ2=10.830，P=0.013)。見表1、圖1。

A：Claudin-1表達(+)；B：Claudin-1表達(++)；C：Claudin-1表達(+++)。

圖1 Claudin-1在不同乳腺癌組織中的表達(免疫組織化學，×400)

表1 Claudin-1的表達與乳腺癌病理參數的關系(n)

2.2 Western blot檢測緊密連接蛋白的表達 Cldn-153～80片段的摻入，導致乳腺癌細胞株中Claudin-1及Claudin-2蛋白的表達均下調，其中，相對于轉移性較低的MCF-7乳腺癌細胞株而言，Claudin-1及Claudin-2蛋白在轉移性較高的MDA-MB-231乳腺癌細胞株中的表達顯著下調(圖2)。

A：Cldn-153～80片段的摻入后乳腺癌細胞中Claudin-1蛋白的表達下降。B：Cldn-153～80摻入后乳腺癌細胞中Claudin-2蛋白的表達下降。

圖2 摻入Cldn-153～80片段導致乳腺癌細胞中Claudin-1、Claudin-2蛋白表達的變化

3 討 論

乳腺癌的轉移常發生在骨骼、肝臟、顱腦和肺部，并成為了該病致死的主要因素[4-5]。乳腺癌在發生轉移的過程中，乳腺上皮細胞獲得間質細胞的特性，失去典型的上皮細胞黏附性及極性，并被誘導增殖，從而獲得遷移能力，誘使腫瘤細胞離開原發部位通過血管和淋巴管向遠處轉移[6]。乳腺癌細胞的遠處轉移包含了向細胞外基質及基質層細胞侵襲、入侵循環系統并存活于其中、溢出至靶器官、建立轉移器官中的腫瘤微環境及在轉移器官中克隆增殖等一系列細胞生物學事件[7]。

緊密連接(tight junctions,TJs)是維持上皮細胞間屏障功能的結構基礎，Claudins蛋白、ZO蛋白、E-cadherin蛋白等都是構成緊密連接的重要成分。其中，Claudins家族是維持緊密連接結構的主要跨膜蛋白。而科學家首先發現并命名Claudin-1在維持緊密連接功能和上皮細胞屏障中至關重要[8-9]。

本研究顯示，在有淋巴結轉移的乳腺癌組織中，Claudin-1的表達顯著低于無淋巴結轉移組；隨著腫瘤TNM期別的延遲，Claudin-1的表達趨于減弱；Her-2過表達型的乳腺癌細胞中該蛋白的表達也有顯著性的降低。以上結果表明了Claudin-1低表達的乳腺癌細胞中，其上皮細胞屏障功能的減弱，增加了乳腺癌細胞的侵襲力，導致乳腺癌轉移的風險明顯增加。最新研究發現，乳腺癌的分子分型中，除具特征性的luminal A、luminal B、Her-2過表達型、三陰性乳腺癌外，Claudin-1低表達型也可望成為具有指導治療評估預后的新分型[10]。這說明Claudin-1在乳腺癌中的表達狀況可望成為判斷或預測乳腺癌復發轉移的指標之一。大量研究表明，Claudin-1的低表達與乳腺癌的高轉移性密切相關，但其中的具體機制尚缺乏進一步研究。

Claudin-1蛋白由兩個胞外環(extracellular loop,EL)和細胞內的N-端和C-端組成。這兩個EL 區域對TJs的構成及維護有重要意義[11-12]。有研究發現，Claudin-1的兩個EL區域可分為3段：Cldn-131～53、Cldn-153～80、Cldn-1146～160[13]。在對腸上皮細胞緊密連接的研究中發現，外源性Cldn153～80可阻斷TJs的修復，可導致緊密連接中相關分子如Occludin、JAM、ZO-1等的表達及定位缺失，使TJs功能降低，從而影響緊密連接的結構和功能。作者推測，在乳腺癌發生侵襲、轉移的過程中，Cldn153～80可能扮演重要角色。

本研究發現，在高轉移性的乳腺癌細胞株MDA-MB-231，和低轉移性的MCF-7細胞株中分別摻入外源性Cldn153～80片段，提示Cldn-153～80的摻入導致乳腺癌細胞中Claudin-1及Claudin-2蛋白表達下降，并且相對于轉移性較低的MCF-7乳腺癌細胞株而言，該片段的作用是顯著抑制轉移性高的MDA-MB-231乳腺癌細胞株中Claudin-1及Claudin-2蛋白的表達。

有研究發現，乳腺癌的微環境直接影響乳腺癌的增殖與轉移，在乳腺癌微環境中，存在大量的除腫瘤細胞外的細胞成分[14]，而這些具有活性的生物大分子正是引導腫瘤細胞增殖、轉移的關鍵介質。本研究顯示，外源性Claudin-153～80片段的摻入，使Claudin-1、Claudin-2表達降低，相對于轉移性較低的乳腺癌細胞株MCF-7，在高轉移性的乳腺癌細胞株MDA-MB-231中，Cldn-153～80片段的作用顯著下調了緊密連接蛋白Claudin-1及Claudin-2的表達。因此推斷，在乳腺癌發生、發展、轉移的過程中，腫瘤微環境中存在Claudin-1的胞外區片段，其中包括Cldn-153～80片段，它的作用可能影響了乳腺上皮細胞緊密連接的結構與功能，使乳腺上皮細胞緊密連接的結構與功能顯著破壞，使腫瘤細胞的侵襲力得以增長。本研究提出，緊密連接蛋白Claudin-1的胞外區片段Cldn-153～80可通過抑制緊密連接蛋白Claudin-1及Claudin-2的表達來提高乳腺癌細胞的侵襲力，從而增強乳腺癌的轉移性，闡明了Claudin-1的胞外區片段Cldn-153～80在乳腺癌轉移機制中可能發揮重要作用，其中機制有待進一步研究。

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A Key Claudin Extracellular Loop Domain is Critical for the metastatic of breast cancer*

PengYaqi,CaiYujiao△,JiangEnlai,SunLihua

(DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedXinqiaoHospitalofThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To investigate the expressions of tight junction protein claudin-1 in breast cancer tissue and the regulation with the domaination of extracellular loop Cldn-153-80.Methods The expressions of Claudin-1 in the breast cancer samples (n=108) were detected by immunohistochemistry technology.The expressions of Claudin-1 and Claudin-2 with the inception of Cldn-153-80were detected by the technology of Western Blot.Results The expression level of Claudin-1 were associated with lymph node metastases,clinical stage and the molecular typing of breast cancer(P<0.05).Besides,the inception of Cldn-153-83lead to a lower expression of Claudin-1 and Claudin-2(P<0.05).Conclusion Claudin-1 shows a decreasing trend in development and metastases of breast cancer,and Cldn-153-80domain of claudin-1 plays a key role in the regulation of TJ function in breast cancer.

breast neoplasms;lymphatic metastasis;Claudin-1;metastatic;extracellular loop;Cldn-153-80

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.007

重慶市自然科學基金面上項目(cstc2012jjA10078)。作者簡介：彭亞琪(1990-)，住院醫師，碩士，主要從事惡性腫瘤的放化療與綜合治療。△

，E-mail:cyj760628@163.com。

R737.9

A

1671-8348(2016)34-4772-03

2016-05-18

2016-08-06)