沉默Pin1表達抑制高氧誘導人肺泡上皮細胞凋亡中SIRT1核-漿穿梭*

趙 帥，董文斌，李清平，康 蘭，雷小平，周正頤

(西南醫科大學附屬醫院新生兒科，四川瀘州 646000)

沉默Pin1表達抑制高氧誘導人肺泡上皮細胞凋亡中SIRT1核-漿穿梭*

趙 帥，董文斌△，李清平，康 蘭，雷小平，周正頤

(西南醫科大學附屬醫院新生兒科，四川瀘州 646000)

目的 通過沉默Pin1表達觀察高氧誘導人肺泡上皮細胞凋亡中組蛋白去乙酰化酶(SIRT1)核-漿穿梭改變。方法 在體外常規培養A549細胞及A549-Pin1shRNA細胞，隨機分為對照組(常規培養)和高氧組、A549-Pin1shRNA細胞組(均給予高體積分數氧誘導細胞)。密閉培養24 h后,倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態改變；免疫組織化學方法檢測各組細胞中Caspase 3、 p53蛋白在各組細胞中的表達情況；免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭變化。結果 對照組細胞生長狀態良好，細胞呈梭形，活細胞數量較多。高氧組細胞生長狀態差，細胞由原來的梭形變成橢圓形。A549-Pin1shRNA組細胞生長狀態欠佳，貼壁欠佳，活細胞數量較高氧組有所增加，但是未達到對照組的水平。對照組密閉培養24 h,高氧組、A549-Pin1shRNA組通氧后密閉培養24 h后，對照組中Caspase 3、p53表達最少，與高氧組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；而A549-Pin1shRNA組在通氧后密閉24 h，Caspase 3、 p53表達介于對照組與高氧組之間，與各組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。在免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭改變中，對照組未見SIRT1核-漿穿梭改變，而A549-Pin1shRNA組較高氧組減少。結論 抑制Pin1表達能夠減少人肺泡上皮細胞凋亡中SIRT1核-漿穿梭。

肺泡；上皮細胞；細胞凋亡；Pin1；SIRT1；核-漿穿梭

隨著醫療技術的不斷發展，越來越多的治療手段用于新生兒的救治過程，在救治過程中患兒往往需要長時間吸入高體積分數氧(高氧)，可能引起肺部出現氧化應激反應、肺血管重構等，繼而發展至肺纖維化及支氣管肺發育不良(BPD)[1]。BPD仍是目前兒童慢性呼吸系統疾病中最主要的病因，其增加了兒童再入院率和病死率，嚴重影響兒童生長發育及生活質量[2]。組蛋白去乙酰化酶(SIRT1)作為哺乳動物生命周期相關蛋白，其主要功能是調節細胞氧化應激反應和調控生命周期。SIRT1主要定位于細胞核，在細胞能量代謝、DNA損傷修復、細胞周期控制、抑制細胞凋亡、抗氧化應激和延長細胞壽命方面發揮極重要的調控作用，是機體內十分重要的抗氧化應激的關鍵蛋白[3-4]。由于目前大多數學者認為氧化應激是高氧肺損傷的主要形式，所以對其研究重點仍然是從信號通路入手。本課題組前期實驗已經得到證實，在高氧環境下會激活 PKCβ產生,從而使細胞質內p66Shc發生磷酸化,隨后被Pin1識別發生異構化(Pin1主要作用是介導p66Shc在線粒體轉位),進而在蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A) 去磷酸化的作用下進入線粒體，活化后的 p66Shc轉移到線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ氧化細胞色素c產生ROS/H2O2[5-7]。故在Pin1介導的p66shc轉位的氧化應激通路中，通過抑制Pin1基因的表達，能夠減輕高氧誘導活性氧產生對肺組織的損傷[8]。而SIRT1一般情況下存在于細胞核內，其活性主要在細胞核內發揮作用，在機體內參與部分組織的氧化應激過程，當其受到高氧損傷時，能否發生核-漿穿梭反應，導致SIRT1活性降低，抗氧化應激能力下降，而在抑制了Pin1表達的A549細胞中能否減輕SIRT1核-漿穿梭反應都尚無相關實驗研究。本實驗通過研究Pin1介導高氧誘導人肺泡上皮細胞凋亡中SIRT1核-漿穿梭情況，希望能夠為高氧肺損傷治療提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 在體外常規培養的人A549肺泡上皮細胞，分為對照組、高氧組，對照組置于5% CO2培養箱中常規培養，高氧組與前期課題組中抑制Pin1表達的A549-Pin1shRNA組細胞分別給予高體積分數氧(高氧)誘導細胞[8]，即通入3 L/min的90%氧氣和5%二氧化碳高純混合氣10 min，并在培養箱中密閉培養24 h后檢測下述指標。

1.2 細胞形態學觀察 各組細胞分別密閉培養24 h后，在IX71型倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態變化。

1.3 免疫組織化學法檢測各組細胞中Caspase 3、p53蛋白的表達 采用SP免疫組織化學法檢測胱冬肽酶(Caspase) 3和p53蛋白的表達情況。實驗中Caspase 3和p53蛋白抗體的稀釋度分別為1∶150和1∶200。按照說明書進行操作，細胞質染成棕黃色為陽性表達。實驗重復3次，每張爬片任選8個高倍鏡圖片，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞，采用Image-pro6.0圖像分析軟件對圖像進行分析，測定其平均吸光度值(A)。

1.4 免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭變化 細胞核采用DAPI染色成藍色熒光，SIRT1通過免疫熒光法染色成紅色熒光。正常情況下，SIRT1位于細胞核內，紅色熒光與藍色熒光重合。當細胞受到氧化應激反應時，SIRT1發生核-漿穿梭，從細胞核往細胞質移動，紅色熒光向外移動，通過熒光顯微鏡下觀察紅色熒光與藍色熒光分離的現象。

2 結 果

2.1 細胞形態學觀察 建立高氧細胞模型，將實驗分為對照組、高氧組和A549-Pin1shRNA組。通過倒置相差顯微鏡對細胞形態進行觀察。對照組細胞生長狀態良好，細胞呈梭形，活細胞數量較多，細胞與細胞之間連接緊密，有少量細胞漂浮。高氧組細胞生長狀態差，細胞由原來的梭形變成橢圓形，細胞之間間隙增寬，培養基中可見大量的懸浮細胞。A549-Pin1shRNA組細胞生長狀態欠佳，貼壁欠佳，活細胞數量較高氧組有所增加，懸浮細胞數較高氧組減少，細胞之間間隙較對照組仍有增寬，但是未達到對照組的水平(圖1)。對照組細胞生長狀態良好，高氧組細胞生長狀態差，細胞由原來的梭形變成橢圓形，A549-Pin1shRNA組細胞生長狀態欠佳，活細胞數量較高氧組有所增加，懸浮細胞數較高氧組減少，細胞之間間隙較對照組仍有增寬，但未達到對照組的水平。

2.2 免疫組織化學法檢測各組細胞中Caspase 3、p53蛋白的表達 在免疫組織化學法中Caspase 3、 p53蛋白陽性表達為位于細胞質中的金黃色或者黃褐色。本實驗中，對照組密閉培養24 h,高氧組、A549-Pin1shRNA組通氧后密閉培養24 h后，檢測各種細胞中Caspase 3、 p53蛋白表達情況，結果通過A值進行分析。 對照組中Caspase 3、 p53蛋白在3組中表達最少，在通氧后密閉24 h，高氧組細胞中Caspase 3和p53蛋白表達明顯增加(t=-9.941，P=0.006；t=-7.536，P=0.017)。A549-Pin1shRNA組在通氧后密閉24 h，Caspase 3和p53蛋白表達水平明顯高于對照組(t=5.439，P=0.012；t=6.87，P=0.000)，但低于高氧組(t=5.671，P=0.000；t=4.763，P=0.034)。見圖2、表1。

圖1 細胞形態變化(倒置相差顯微鏡，×100)

表1 各組Caspase 3、p53蛋白表達水平的A值比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與高氧組比較。

Caspase 3和p53蛋白陽性表達為位于細胞質中的金黃色或者黃褐色。與對照組相比，高氧組和A549-Pin1shRNA組Caspase 3、p53蛋白陽性表達增加；A549-Pin1shRNA組中Caspase 3、p53蛋白陽性表達介于對照組與高氧組間。

圖2 SP細胞免疫化學方法檢測各組細胞中Caspase 3和 p53蛋白的表達(×200)

2.3 免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭改變 通過熒光顯微鏡對各組細胞進行觀察。細胞核通過DAPI染色成藍色熒光，SIRT1通過免疫熒光法染色成紅色熒光，通過細胞質/細胞核的熒光值(A值)進行統計學分析，通過熒光顯微鏡下觀察紅色熒光與藍色熒光分離的現象，細胞質中紅色熒光明顯增多。在對照組中細胞質/細胞核為 0.00±0.00，在通氧后密閉24 h，高氧組SIRT1核-漿穿梭明顯增加，為0.36±0.12(t=5.932，P=0.001)，A549-Pin1shRNA組在通氧后密閉24 h，SIRT1核-漿穿梭增加，為0.21±0.09(t=4.217，P=0.015)。而A549-Pin1shRNA組中細胞質/細胞核較高氧組減少，差異具有統計學意義(t=25.346，P=0.000)，見圖3、表2。

表2 各組SIRT1細胞質/細胞核的A值比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與高氧組比較。

細胞核通過DAPI染色成藍色熒光，SIRT1通過免疫熒光法染色成紅色熒光。高氧組中紅色熒光與藍色熒光分離明顯增高，而A549-Pin1shRNA組紅色熒光與藍色熒光分離低于高氧組，高于對照組。

圖3 免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭情況(倒置相差顯微鏡，×200)

3 討 論

由于機械通氣、肺表面活性物質的普遍應用及早產兒管理技術的提高，危重新生兒存活率顯著提高。與此同時，越來越多的學者發現存活的患兒中肺部出現氧化應激反應，繼而發展至肺纖維化及支氣管肺發育不良，對患兒生活質量造成影響。所以越來越多的研究者將研究重點放在高氧誘導肺泡上皮細胞損傷的機制上。

Pin1也稱作肽基脯氨酰異構酶,其主要作用是能特異地識別和結合蛋白質磷酸化的絲/蘇-脯氨酸基序，催化磷酸化的絲/蘇-脯氨酸肽鍵發生順反異構，從而改變磷酸化蛋白質的功能[9]。現在對于Pin1的主要研究熱點集中于以下幾個方面：(1)參與阿爾茲海默病信號通路的調節[10]；(2)與cyclinD1參與細胞腫瘤周期的調控[11]；(3)激活線粒體p53通路的死亡程序[12]；(4)與磷脂酰肌醇5磷酸通過激活脯氨酸激酶參與氧化應激通路，使活性氧的產生減少[13]。而本課題組前期證明，抑制Pin1表達后，與高氧組相比， Caspase 9產生減少，XIAP生成增加，活性氧出現減少，膜電位有所升高，說明Pin1參與了p66chc介導的氧化應激通路，抑制其表達能夠有效減輕高氧所造成的急性肺損傷。

SIRT1也稱作沉默交配型信息調節因子2同源蛋白1,是哺乳動物sirtuin家族(SIRT1-SIRT7)成員之一，是一類具有NAD+依賴性的組蛋白/非組蛋白去乙酰化酶[14]。SIRT1抗細胞凋亡的機制可能與p53去乙酰化有關，其能使p53蛋白的第373、320和382位賴氨酸殘基去乙酰化，從而抑制p53與靶DNA順式原件結合，進而抑制p53促凋亡活性[15]。目前國內外學者對SIRT1- p53信號通路研究主要集中在腦、腎臟、心肌等缺血再灌注損傷、糖尿病、動脈粥樣硬化導致的血管病變中的保護作用。但是該通路與高氧肺損傷關系的研究，國內外少見文獻報道。

本實驗主要是在抑制Pin1表達的A549細胞中，給予高氧誘導后，其與A549細胞的對照組和高氧組進行相關指標的檢測。倒置相差顯微鏡觀察發現，A549-Pin1 shRNA組細胞生長狀態欠佳，但活細胞數量較高氧組有所增加，懸浮細胞數較高氧組減少，細胞之間間隙較對照組仍有增寬，但是未達到對照組的水平。在免疫組織化學檢測結果中得到，A549-Pin1 shRNA組Caspase 3、p53蛋白的表達較高氧組有所減少；在免疫熒光法定位SIRT1核-漿穿梭改變中，A549-Pin1 shRNA組SIRT1核-漿穿梭較高氧組減少，減輕穿梭后造成的SIRT1活性的下降。

由此，推測Pin1介導高氧誘導人肺泡上皮細胞凋亡中SIRT1核-漿穿梭中，抑制Pin1表達能夠減少SIRT1從細胞核向細胞質中穿梭，從而減少SIRT1活性降低、抗氧化應激能力下降，此通路研究有望為高氧肺損傷治療提供新的治療方法。

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Silencing of Pin1 suppresses the changes of SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling in apoptosis of human alveolar epithelial cells*

ZhaoShuai,DongWenbin△,LiQingping,KangLan,LeiXiaoping,ZhouZhengyi

(DepartmentofNeonatology,theFirstAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the role of silence Pin1 expression suppress the changes of SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling in apoptosis of human alveolar epithelial cells.Methods The A549 cells and A549-Pin1shRNA cells were divided into the control group,the hyperoxia group and the A549-Pin1shRNA group.The change of morphology were observed under inverted microscope after exposure to oxygen or room air for 24 hours;the expression of protein Caspase 3and p53 were detected by immunohistochemical methods.the change of SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling were detected by immunofluorescence.Results Under the inverted microscopy,A549 cells in control group grew in good condition,and were significantly increased.Cells in hyperoxia group grew in bad condition,and they turned to oval from the original fusiformis.Cells in the A549-Pin1shRNA group grew in bad condition,the live cell number increased compared with that of hyperoxia group,while they did not reach the control group level.After four hours culture in the control group and 24 hours in the hyperoxia group and A549-Pin1shRNA group,the Caspase 3 and p53 were the least in the control group,and there was significant difference of the level between control group and hyperoxia group(P<0.05).But the expression Caspase 3 and p53 of the A549-Pin1shRNA group were between them (P<0.05).Immunofluorescence results showed that the control group had no change of SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling.The A549-Pin1shRNA group were decreased than the hyperoxia group.Conclusion Inhibition of Pin1 expression can reduce the apoptosis of human alveolar epithelial cells SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling.

pulmonary alveoli;epithelial cells;apoptosis;Pin1;SIRT1;nucleocytoplasmic shuttling

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.003

國家自然科學基金資助項目(81571480);四川省教育廳科研基金(08ZA150)；四川省衛生廳科研基金(90191);四川省科技廳-瀘州市科技局-瀘州醫學院2014年聯合科研項目資金(2014NZ0014);瀘州市科技局(瀘州市政府-瀘州醫學院聯合專項資金)( 2013LZLY-J08);中華兒科雜志第二屆雙鶴珂立蘇科研基金。 作者簡介：趙帥(1989-)，住院醫師，碩士，主要新生兒疾病基礎與臨床的研究。△

，E-mail：dongwenbin2000@163.com。

R722.1

A

1671-8348(2016)34-4760-03

2016-06-22

2016-08-26)