MicroRNA-19a/b與胃癌增殖、凋亡及臨床病理特征的關系*

王 芳,王鹓臻,王晶晶,何 芳

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內科，銀川 750004)

·論 著·

MicroRNA-19a/b與胃癌增殖、凋亡及臨床病理特征的關系*

王 芳,王鹓臻,王晶晶,何 芳△

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內科，銀川 750004)

目的 探討microRNA-19a/b(miR-19a/b)對人胃癌細胞的增殖和凋亡的影響及可能機制，并研究miR-19a/b的表達量與胃癌臨床病理特征的關系。方法 建立穩(wěn)定過表達miR-19a/b的SGC7901細胞系，以MTT比色法及平板克隆形成實驗檢測轉染miR-19a/b后細胞增殖變化、 Annexin V- FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡變化，Western blot檢測ERK、p-ERK、AKT、p-AKT及PTEN的蛋白表達變化，實時定量PCR方法檢測分析miR-19a/b與胃癌組織分化程度、TNM分期及淋巴結轉移的關系。結果 在SGC7901細胞中過表達miR-19a/b后產(chǎn)生以下效應： 細胞增殖能力增加，MTT實驗顯示轉染miR-19a及miR-19b后檢測72 h的細胞增殖能力與對照組相比分別增加2.2倍和1.6倍，平板克隆實驗顯示轉染miR-19a及miR-19b后細胞的克隆形成能力與對照組相比分別增加3.6倍和3.0倍；細胞凋亡減少，轉染miR-19a及miR-19b后細胞的凋亡能力與對照組相比分別降低53%和33%，與對照組相比， p-AKT、p-ERK蛋白表達水平增加，PTEN蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在58例胃癌組織標本檢測中，miR-19a/b的miRNA表達水平與年齡、性別、分化程度無關(P>0.05)，而與TMN分期、淋巴結轉移成負相關(P<0.05)。結論 miR-19a/b可促進胃癌細胞增殖、抑制細胞凋亡，且與胃癌的TMN分期、淋巴結轉移呈負相關。

胃腫瘤；細胞凋亡；細胞增殖；病理學；miR-19a/b

胃癌是全球常見的第二大腫瘤，我國每年新發(fā)病例約40萬例，占世界總發(fā)病例數(shù)的42%[1-2]。由于胃癌及癌前病變的癥狀具有隱匿性和無特異性，因此多數(shù)患者通過臨床癥狀就診時多為中晚期，治療效果和預后較差。若能顯著提高早期診斷的特異性，將極大提高患者的生存率和預后。目前已發(fā)現(xiàn)的血清腫瘤標志物對胃癌的診斷意義有限，因此繼續(xù)探尋敏感性及特異度兼有的胃癌標志物對于提高胃癌的早期診斷率、改善胃癌患者預后具有非常重要的意義。通過上調人胃癌細胞SGC7901中miR-19a/b的表達，觀察胃癌細胞增殖、凋亡變化，以及對AKT、p-AKT、ERK、P-ERK及PTEN蛋白表達變化，進一步探討miR-19a/b在SGC7901細胞中的增殖和凋亡的作用機制及與胃癌臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌細胞SGC7901引自北京軍事醫(yī)學科學院，由寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院實驗室保存，RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清(Hyclone公司)，hsa-miR-19a、hsa-miR-19b及has-miR-NC(上海吉凱基因化學技術有限公司)、聚凝胺(Santa公司)、Trizol及RT-PCR相關試劑(大連TaKaRa公司)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，F(xiàn)ITC-annexin V/PI凋亡試劑盒(美國BD)，四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、PTEN抗體[賽俊通(上海)生物試劑有限公司]。

1.1.2 石蠟病理標本 選擇有電話隨訪的、在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院住院行手術治療的胃癌患者的癌組織及癌旁組織石蠟病理標本，患者術前均未接受過放療或化療，術后病理證實為胃癌。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞SGC7901接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉染及鑒定 將SGC7901細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔接種細胞1×105個。在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜后吸凈培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，每孔加入無血清培養(yǎng)基0.5 mL、8 μg/mL的聚凝胺、2 μL慢病毒包被的hsa-miR -19a(miR-19a組)、has-miR-19b(miR-19b組)或空白載體(NC組)，孵育4～6 h后每孔再加入含血清的培養(yǎng)基2.5 mL繼續(xù)孵育，轉染后72 h熒光顯微鏡下觀察GFP發(fā)光情況。

1.2.3 實時熒光定量RT-PCR檢測 轉染后72 h收集轉染細胞，檢測轉染細胞miR-19a/b的表達以驗證轉染效果；細胞轉染后按照Trizol說明書提取總RNA，以特異性引物為模板，應用PrimeScript RT reagent Kit催化合成cDNA。應用SYBR Premix Ex TaqⅡ進行實時定量PCR，以cDNA為模板進行PCR擴增。根據(jù)Hsa-miR-19的基因信息，設計引物(1)miR-19a：5′-TGT GCA AAT CTA TGC AAA ACT GA-3′；(2)miR-19b：5′-TGT GCA AAT CCA TGC AAA ACT GA-3′；U6為內參，進行歸一化。樣品目的基因的相對表達率(Relative Expression，RQ)采用△△CT方法計算。

1.2.4 細胞增殖能力的檢測 (1)MTT法檢測各組細胞的增殖活性：將對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉染細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，分別在24、48、72 h每孔加入MTT 20 μL (5 mg/mL)，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后取出培養(yǎng)板，棄上清液，每孔加150 μL DMSO溶解甲瓚藍紫色顆粒，振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長為490 nm的吸光度值(A值)。每組設6個平行孔，取均值繪制細胞生長曲線。(2)平板克隆形成實驗：對數(shù)生長期的轉染細胞以胰酶消化成單細胞懸液，每孔200個接種于6孔板中，靜止培養(yǎng)2周，肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加甲醇1 min，吉姆薩液染色。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 流式細胞儀檢測細胞凋亡按Annexin V- FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作。各組細胞加入5-FU(終濃度為15 μg/mL)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS洗滌3次，加入0.5 mL結合緩沖液重懸細胞，再加入6 μL FITC- Annexin V和20 μL PI，室溫避光孵育15 min，離心棄上清液，加入300 μL結合緩沖液，流式細胞儀檢測凋亡率，計數(shù)1×104個細胞。實驗重復3次。

1.2.6 蛋白質免疫印跡法(Western blot) 檢測各組細胞AKT、p-AKT、ERK、p-ERK及PTEN的表達變化。將細胞裂解提取總蛋白，進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并轉至硝酸纖維素膜上，常規(guī)封閉、一抗孵育過夜，后孵育二抗，用化學發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集成像。目的蛋白相對表達量=目的條帶的灰度值/同一樣本內參的灰度值。

2 結 果

2.1 穩(wěn)定過表示miR-19a/b的SGC7901細胞系的建立 慢病毒包被的含熒光蛋白(GFP)的hsa-miR-19a、hsa-miR-19b及空白載體hsa-miR-NC分別感染親本細胞SGC7901，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)慢病毒載體在表達特定miRNA的同時表達綠色熒光蛋白(圖1)。

圖3 MTT法檢測不同時間段各組細胞增殖能力變化

2.2 RT-PCR檢測轉染miR-19a/b后miRNA的表達變化 各組細胞轉染miR-19a/b后提取總RNA，采用Real-time- PCR定量檢測miR-l9a/b表達情況。結果顯示，穩(wěn)定轉染miR-19a/b的細胞miRNA表達量與NC相比明顯上調，轉染后72 h時檢測miR-19a的miRNA水平較對照組增加12.5倍，miR-19b的miRNA水平較對照組增加15.0倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 MTT檢測細胞生長曲線 24、48、72 h分別檢測miR-19a/b細胞的增殖能力，結果顯示轉染miR-19a及miR-19b后細胞的增殖能力比NC組明顯增高，72 h轉染miR-19a及miR-19b后細胞的增殖能力比NC組分別增加2.2倍和1.6倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

2.4 平板克隆形成實驗 穩(wěn)定轉染miR-19a/b后形成的克隆數(shù)明顯高于NC組，轉染miR-19a及miR-19b后細胞的克隆數(shù)與NC組相比分別增加3.6倍和3.0倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。

圖4 平板克隆形成實驗檢測miR-19a/b組與NC組相比細胞增殖能力變化

2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果 各組細胞加入5-FU(15 μg/mL)48 h以后檢測細胞凋亡率，轉染miR-19a及miR-19b后細胞的凋亡能力與NC組相比分別降低53%和33%，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 miR-19a/b組與NC相比細胞凋亡情況

2.6 Western blot檢測結果 miR-19a/b組與NC組相比PTEN蛋白水平明顯降低，p-AKT、p-ERK蛋白水平明顯增加，見圖6。

2.7 58例胃癌與癌旁組織標本中檢測miR-19a/b的表達 結果顯示miR-19a/b在癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，miR-19a在癌組織的表達量是癌旁組織表達量的3.6倍，miR-19b在癌組織的表達量是癌旁組織表達量的4.5倍，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖7。

2.8 58例胃癌組織中miR-19a/b的表達與臨床病理特征的關系 結果顯示miR-19a/b的表達與年齡、性別、分化程度無關，與TNM分期、淋巴結轉移呈負相關，見表1。

圖6 miR-19a/b組與NC的PTEN、AKT、p-AKT、ERK及p-ERK的蛋白表達變化

圖7 miR-19a/b在胃癌和癌旁組織中的表達差異

表1 胃癌組織中miR-19a/b的表達與臨床病理特征的關系

3 討 論

miRNAs作為一種新的調節(jié)分子不僅參與生物的生長發(fā)育等多種生命過程，也可作為一種新的致癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，影響腫瘤患者的預后。miRNA的相關研究為胃癌等腫瘤的基因診斷、治療提供了新靶點。

miR-17-92基因簇為一種典型的含有多順反子啟動子的高度保守的基因簇，位于人染色體13q31.3處[3]，產(chǎn)生miR-17-5p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1、miR-92-1共6個成熟的miRNAs。根據(jù)基因簇成員間種子序列的不同，可將其成員分為3個家族，其中miR-19家族包括miR-19a和miR-19b。

研究發(fā)現(xiàn)miR-17-92與腫瘤關系密切，具有癌基因和抑癌基因雙重功能。miR-17-92在多種惡性腫瘤如胃癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌等中過度表達[4-5]，作為致癌基因誘導腫瘤的發(fā)生。有相關文獻報道，miR-17-92在肺癌尤以進展期非小細胞肺癌中顯著上調，可能通過抑制PTEN和PGE2這兩個腫瘤抑制基因發(fā)揮癌基因的作用[6]。最近有報道，miR-17-92基因簇的成分miR-20a和miR-17在乳腺腫瘤中低水平表達，可能起到抑癌基因的作用[7]，這提示miR-17-92可作為腫瘤治療的新靶點。

miR-19a/b是miR-17-92基因簇中最重要的致癌miRNAs。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-19a/b負性調控靶基因的表達，與乳腺癌細胞株侵襲遷移能力呈負相關，可作為評估乳腺癌惡性程度的重要標志。Takakura等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-19靶向于PTEN發(fā)揮對甲狀腺癌的促增殖作用。Ye等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-19在急性T淋巴細胞白血病中表達上調，可能作為癌基因發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)上調miR-19a/b的表達，細胞增殖能力明顯增加，細胞凋亡率降低，結果表明miR-19a/b對胃癌細胞的增殖和凋亡有調控作用，起到癌基因的作用。

PTEN是第一個被發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的抑癌基因，調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡和物質代謝[11-12]，大多實體瘤中存在PTEN基因的突變或缺失[13-15]，被認為是一種重要的抑癌基因。如PTEN基因發(fā)生突變或缺失其抑癌功能將會減弱甚至喪失，最終導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。對miRNAs的進一步研究發(fā)現(xiàn)很多的miRNAs通過靶向于PTEN而影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移、侵襲和耐藥等。Liang等[16]報道m(xù)iR-19a/b通過靶向于PTEN調節(jié)乳腺癌的多藥耐藥。Meng等[17]報道m(xù)iR-21通過靶向于PTEN而影響肝細胞的生長發(fā)育，最終誘導肝癌發(fā)生。Huse等[18]報道了在膠質瘤患者中miR-216表達明顯上調，并伴有PTEN明顯下調。Yang等[19]報道卵巢癌細胞中miR-214低表達，且抑制PTEN的表達。

文獻報道PTEN可負向調控包括AKT及ERK信號通路在內的多種細胞內信號傳導通路，從而調節(jié)細胞的生長、發(fā)育及抑制腫瘤細胞增殖、黏附、轉移。AKT是絲/蘇氨酸蛋白激酶，PI3K/AKT信號轉導通路是重要的“凋亡抑制”通路[20]。AKT的過度活化可以調節(jié)多種下游底物，參與調節(jié)細胞的生長、發(fā)育、分化、分裂等多種生理過程，是細胞內信號轉導的樞紐分子之一。胞外信號調節(jié)激酶(ERK)是RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的重要成分，活化的ERK(P-ERK)作用于其下游底物,促進多種癌基因及細胞周期調節(jié)相關基因的轉錄與表達，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本實驗表明，SGC7901細胞轉染miR-19a/b后p-AKT、p-ERK的表達水平增加，PTEN表達水平降低，可能機制為miR-19a/b負向調控PTEN基因的表達，導致p-AKT及p-ERK的信號通路異常激活[21-22]，使細胞異常增殖及惡性轉化，并促進腫瘤浸潤、轉移。

對58例石蠟包埋胃癌組織及相應癌旁組織中miR-19a/b的表達檢測發(fā)現(xiàn)miR-19a/b在胃癌組織中過表達。在分析miR-19a/b表達與臨床病理特征關系時，發(fā)現(xiàn)miR-19a/b的miRNA表達水平與年齡、性別、分化程度無關，與胃癌患者的臨床分期、淋巴結轉移有相關性(P<0.05)，進一步證明了miR-19是成瘤基因，可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起到癌基因的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a/b通過PTEN/AKT/ERK通路促進胃癌細胞增殖，降低細胞凋亡；通過臨床組織標本檢測發(fā)現(xiàn)miR-19a/b與胃癌臨床分期及轉移密切相關。以上實驗表明miR-19a/b有望成為胃癌治療的一個潛在干預靶點，并可為診斷和基因治療提供依據(jù)，為開發(fā)新的抗腫瘤藥物及指導臨床治療提供新的思路。

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The relation between microRNA-19a/b and proliferation,apoptosis and clinicopathological features of gastric cancer*

WangFang,WangWanzhen,WangJingjing,HeFang△

(DepartmentofGastroenterology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China)

Objective To explore the effects of miR-19a/b on proliferation,apoptosis of gastric cancer cells and elucidate its possible mechanism by infecting the human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901.Then investigate the relation between the levels of miR-19a/b and the clinicopathological featrues of gastric cancer.Methods The stable cells which expressed miR-19a/b were stabled.The changes of cellular growth activity were detected by MTT and colony formation assay and the apoptosis were detected by flow cytometry.The expression of AKT,p-AKT,ERK,p-ERK and PTEN were examined by Western blot.By using Real-Time quantitative PCR,the expression of miR-19a/b were evaluated in gastric cancer tissues.To analyze the relationship of the miR-19a/b in degree of differentiation,lymph node metastasis,TNM stage in gastric cancer tissues.Results The miR-19a/b expression in stable cell lines were significantly increased much than that of the control group(P<0.05)by using RT-PCR.Ectopic miR-19a/b expression in SGC7901 cell could produce the following effects:the proliferation increased(P<0.05),the cell apoptosis decreased.And the Expression of the protein expressions of p-AKT and p-ERK upregulated,the expression of PTEN down regulated in miR-19a/b infected group than those in miR-NC group.Also we found that the expression of miR-19a or miR-19b in gastric cancer patients did not correlate with age,gender or cell differentiation,but correlated with TNM stage and lymph node metastatic in gastric cancer tissues.Conclusion We find that the expression of miR-19a/b are over-expressed in gastric cancer tissues,miR-19a/b up-regulation can promote the cellular proliferation and reduce apoptosis.The present study demonstrates that there is a close relationship between the levels of miR-19a/b and TNM stage and lymph node metastatic in the gastric cancer.Our date study suggests that miR-19a/b would be an effective clinical parameter to indicate the malignance of gastric cancer.

stomach neoplasms;apoptosis;cell proliferation;pathology;miR-19a/b

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.001

寧夏醫(yī)科大學青年項目基金(XQ201334)。 作者簡介：王芳(1979-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事消化道腫瘤。△

，E-mail：blue0708@163.com。

R735.2

A

1671-8348(2016)34-4753-04

2016-07-18

2016-09-06)