豬混合感染牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、藍耳病病毒和大腸桿菌的診斷

王宇婷，常敬偉，李超，馬莉莉，周玉龍，倪宏波

豬混合感染牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、藍耳病病毒和大腸桿菌的診斷

王宇婷，常敬偉，李超，馬莉莉，周玉龍，倪宏波?

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶163319）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）不僅感染奶牛和黃牛，還會感染豬、鹿和羊等多種動物。豬感染BVDV會出現類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化。本試驗通過對黑龍江大慶市某豬場送檢的病豬進行實驗室診斷，確診該病豬為牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬藍耳病病毒和大腸桿菌混合感染。

牛病毒性腹瀉病毒；豬瘟病毒；豬藍耳病毒；大腸桿菌；混合感染

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬，與豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和羊邊界病病毒（border disease virus，BDV）同為瘟病毒屬，三者病毒上血清學存在交叉反應[1]。CSFV和BVDV均可感染豬，豬感染CSFV會引起高熱和敗血癥等致病性癥狀[2]。而豬感染BVDV表現出的癥狀與慢性豬瘟類似，CSFV與BVDV之間還存在交叉感染的情況。豬藍耳病也稱為豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive an-drespiratory syndrome，PRRS），該病主要引起豬的繁殖障礙和呼吸道癥狀，PRRSV感染豬后會導致免疫抑制，造成潛在感染其他病原體，從而給豬場造成巨大的經濟損失[3]。豬大腸桿菌（Escherichia coli，E.Coli）病在臨床上主要表現為仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病等，該病具有較高的發病率和死亡率[4]。本文對黑龍江大慶市某豬場發病的保育豬，進行了實驗室診斷，確診為牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和大腸桿菌混合感染，診斷結果報告如下[5]。

1 發病情況

2016年5月，黑龍江省大慶市某豬場保育仔豬出現腹瀉，生長遲緩，發病率高，死亡率10%～20%，用多種抗生素治療效果不佳。豬群曾接種過細胞源豬瘟活疫苗，但未完全控制疫情。

2 臨床癥狀

保育豬體溫升高、精神沉郁、食欲減退，消瘦、腹瀉，生長緩慢，腹部膨脹，雙耳發藍發紺，體表有針尖狀出血點，尤其是腹部皮膚和四肢。

3 剖檢變化

經剖檢病豬，可見喉頭有出血點；頜下淋巴結腫大，周邊有出血點，切面呈大理石樣；彌漫性間質性肺炎；脾邊緣出血性梗死；胃黏膜出血；腸道卡他性炎癥，腸系膜淋巴結充血腫大。

4 細菌分離鑒定與藥敏試驗

無菌采取豬的肝臟、脾臟和肺臟和腸內容物按常規方法分別接種于5%兔血營養瓊脂培養基和麥康凱培養基進行細菌分離鑒定。次日，5%兔血營養瓊脂培養基未發現細菌生長，但在麥康凱培養基上長出桃紅色、圓形和邊緣整齊的菌落，通過鏡檢和生化試驗確定為大腸桿菌[6]。將分離到的大腸桿菌進行致病性試驗，小白鼠24 h內死亡，說明其具有較強致病性。藥敏試驗結果顯示，鹽酸頭孢喹肟和多黏菌素B對大腸桿菌敏感。

5 PCR檢測

5.1 引物設計和合成CSFV和PRRSV特異性檢測引物由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供，BVDV特異性檢測引物參照參考文獻[7]，引物序列如表1所示，引物由上海生物工程技術有限責任公司合成。

表1 引物序列Table1 Primer squence

5.2 樣品的處理與病毒基因組的提取將無菌采集的脾、肺和下頜淋巴結等病料混合加入4 mL的DEPC水，充分研磨均勻，吸取研磨好的液體，加入到無RNA酶的EP管內。根據病毒基因組RNA試劑盒（購自北京博凌科為生物科技有限公司）使用說明的操作方法提取組織病料的病毒基因組RNA，并反轉錄為cDNA備用（購自賽默飛世爾科技中國有限公司）。

5.3 PCR PCR的擴增與檢測以反轉的病毒基因組cDNA為模板，進行CSFV、BVDV、PRRSV的PCR擴增。PCR反應體系為：Buffer 2.5μL、MgCl22μL、dNTP 2μL、上下游引物各1μL、模板1μL、加水至25μL。BVDV、CSFV、HPRRSV和PRRSV的PCR擴增程序為：94℃3 min 30 s預變性；94℃35 s變性；72℃40 s延伸，72℃6 min終延伸，30個循環，退火40 s，溫度分別是56、57、55和51℃。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1和圖2所示，CSFV擴增產物位于599 bp大小處均可見特異性條帶，與目的基因相符；HPRRSV和PRRSV PCR擴增產物位于420 bp和 372 bp大小處均可見特異性條帶，與目的基因相符；BVDV PCR擴增產物位于288 bp大小處均可見特異性條帶，與目的基因相符。

圖1 CSFV和PRRS PCR擴增結果Fig.1 The result of CSFV and PRRS PCR

圖2 BVDV PCR擴增結果Fig.2 The result of BVDV PCR

5.4 核酸序列鑒定將臨床組織病料的BVDV陽性擴增產物膠回收（試劑盒購自上海百賽生物技術有限公司）與pMD-18T連接后，選取陽性菌送往哈爾濱博仕生物技術有限公司進行序列測定，將測序結果應用Blast在線軟件GenBank中登錄的序列進行比較分析表明，BVDV陽性PCR擴增產物彼此間序列完全一致，其與GenBank中登錄的BVDV毒株序列（KF006975.1）同源性達97%。

6 診斷結論

經豬場發病情況、臨床癥狀和病理剖檢變化等臨床診斷，以及細菌分離培養、PCR檢測、核酸序列鑒定等實驗室診斷方法確定，該豬場混合感染牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和大腸桿菌。

7 討論

豬感染BVDV主要途徑為豬免疫接種BVDV污染豬用疫苗及接觸到BVDV感染牛羊和BVDV污染的飼料兩種途徑。豬接觸感染BVDV的牛和羊，采食污染BVDV的飼料，飼喂BVDV污染的牛奶或牛羊內臟以及用污染BVDV的飼養工具等都可引起豬感染BVDV。報道顯示，可在接觸到接種BVDV疫苗牛的豬體內檢測到BVDV抗體[8]。

本病例中的臨床組織樣品檢測結果為牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬藍耳病毒和大腸桿菌混合感染。該豬場免疫接種過豬瘟疫苗，但未能完全控制疫情。其原因可能為BVDV的感染可對豬瘟活疫苗的免疫產生干擾作用，其在抑制豬瘟抗體產生的同時，也刺激機體產生BVDV的抗體，從而導致豬瘟免疫失敗。BVDV在一定程度上干擾豬瘟活疫苗的免疫效果，影響CSFV抗體水平。牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒和豬藍耳病毒均具有免疫抑制特性，導致機體免疫力下降，容易混合感染大腸桿菌，并且前期報道過大腸桿菌對常用抗菌藥物耐藥的發展越來越令人擔憂[9]。

一般認為豬感染BVDV主要原因是豬使用了被BVDV污染的生物制品，尤其是豬瘟疫苗，這給豬瘟的預防控制及凈化帶來了新的困難與挑戰。因此，預防控制BVDV在豬群的感染，要加強生物試劑的生產和安全管理，從源頭上遏制BVDV污染的可能性，加強對豬群中BVDV的監測，及時淘汰陽性感染豬，這些應引起廣大獸醫工作者重視。

[1]陶潔，廖金虎，張倩，等.豬感染牛病毒性腹瀉病毒研究進展[J].中國預防獸醫學報，2014，36（5）：410-413.

[2]邱美珍，楊俊，杜麗飛，等.豬群中牛病毒性腹瀉病毒所致的類似豬瘟及檢測方法[J].湖南畜牧獸醫，2015，（2）：4-6.

[3]文麗，趙兵軍.豬藍耳病的研究進展與防控策略[J].浙江畜牧獸醫，2013，38（3）：15-16.

[4]劉峰，張進，劉毅.豬大腸桿菌病防治研究進展[J].湖南畜牧獸醫，2010（6）：1-3.

[5]吳建軍.豬感染牛病毒性腹瀉的診斷[J].畜牧與獸醫，2014，46（11）：109-110.

[6]廖延雄.獸醫微生物實驗診斷手冊[M].北京：中國農業出版社，1995.

[7]王樹成，林建輝，劉宏，等.用MDBK傳代細胞繁殖BVDV毒株的研究[J].中國動物檢疫，1995，12（4）：6-8.

[8]Stewart WC,Carbrey EA,Jenney E W,et al.Bovine viral diarrhea infection in pigs[J].J Am Vet Med Ass,1971,159(11):1556-1563.

[9]教郁，高維凡，胡彩光.大腸桿菌耐藥性研究進展[J].現代畜牧獸醫，2013，5：54-57.

Diagnosis ofthe combined infection bovine viraldiarrhea virus,
classicalswine fever virus,Porcine reproductive an-drespiratory syndrome virus and E.coilin pigs

Wang Yuting,Chang Jingwei,Li Chao,Ma Lili,Zhou Yulong,Ni Hongbo*
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319）

Bovine viral diarrhea virus(BVDV)not only infected cows and cattle,but also infected pigs,sheep,deer and other animals.Pigs infected with BVDV occurs clinical symptoms and pathological changes similar to classical swine fever.In this study of a farm in Daqing City in Heilongjiang infected of pigs for laboratory diagnosis,confirmed that pigs as bovine viral diarrhea virus,classical swine fever virus,porcine reproductive an-drespiratory syndrome virus and Escherichia coli combined infection.

Bovine viral diarrhea virus;Classical swine fever virus;Porcine reproductive an-drespiratory syndrome virus;Escherichia coli;Combined infection

S858.23

B

1672-9692(2016)11-0033-04

2016-09-11

王宇婷（1992-），女，在讀碩士研究生，研究方向：獸醫微生物與免疫學。

倪宏波（1972-），男，教授，主要從事獸醫微生物與免疫學。