雌激素受體基因多態性與黃褐斑發病的關系

白朝

雌激素受體基因多態性與黃褐斑發病的關系

白朝

摘要：目的探討雌激素受體（ER）基因多態性與黃褐斑發病的關系。方法選取56例眼袋處黃褐斑眼袋整形術患者（病例組）以及39例自愿接受眼袋整形術的健康女性（對照組），采用免疫組化檢測不同ER表達，聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）技術分析2組ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ酶切位點基因多態性及ERβ基因RsaⅠ和AluⅠ酶切位點基因多態性，探討ER與黃褐斑發病嚴重程度評分的關系。結果免疫組化結果顯示，病例組部分真皮纖維細胞和血管內皮細胞ERα和ERβ呈陽性表達，而對照組則表達較弱。Spearman相關性分析顯示，ERα和ERβ與黃褐斑評分均呈正相關（rs分別為0.462和0.512，P＜0.05）。ERα基因XbaⅠ基因型在2組中分布差異有統計學意義（P＜0.05），以xx基因型為參照，暴露于X等位基因（Xx+XX）的OR值為2.23（95%CI：1.41～3.89，P＜0.05），ERβ基因AluⅠ基因型在2組中分布差異有統計學意義（P＜0.05），以aa基因型為參照，暴露于A等位基因（AA+Aa）的OR值為1.58（95%CI：1.21～4.29，P＜0.05），RsaⅠ基因型在2組中分布差異有統計學意義（P＜0.05），以rr基因型為參照，暴露于R等位基因（RR+Rr）的OR值為2.37（95%CI：1.19～6.33，P＜0.05）。結論黃褐斑的發病與ERα基因XbaⅠ基因型、ERβ基因AluⅠ、RsaⅠ基因型多態性有關，突變基因增加了黃褐斑發病的風險，其中Xx、Aa和RR基因型易患病。

關鍵詞：黑變病；雌激素受體α；雌激素受體β；多態現象，遺傳；黃褐斑

黃褐斑是臨床上較為常見的色素沉著性皮膚疾病，主要表現為面部、鼻根部色素沉著，且多發于女性。該病與內分泌紊亂、月經不調、睡眠不佳等因素有關［1］。臨床和基礎研究均證實，雌激素受體（ER）升高與黃褐斑的發病有一定相關性［2］，但也有研究認為兩者沒有明顯相關性［3］。目前，黃褐斑尚無非常有效的治療方法［4］。本研究旨在進一步探討ER基因多態性與黃褐斑發病的關系，為臨床提供理論依據。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2013年3月—2015年6月在我院皮膚科門診就診的56例眼袋處黃褐斑眼袋整形術患者（病例組），均為女性，年齡19～47歲，平均（28.45±4.37）歲，所有患者均符合參考文獻［5］診斷標準，患者在3個月內未服用任何激素類藥物，且無系統性和免疫性皮膚疾病。另選取我院同期自愿接受眼袋整形術的39例健康女性作為對照組，年齡20～48歲，平均（29.13±4.52）歲。所有受試對象均簽署知情同意書，并報醫院倫理委員會批準執行。

1.2實驗方法

1.2.1黃褐斑嚴重程度評分采用安琪兒色素分析軟件（廣州比特公司生產），其中皮損面積評分：0分為無皮損，1分為眼袋每側皮損面積＜2 cm2，2分為皮損面積2～4 cm2，3分為皮損面積＞4 cm2。皮損顏色評分：0分為正常膚色，1分為淡褐色，2分為褐色或者褐棕色，3分為深褐色，總積分=皮損面積評分+皮損顏色評分。

1.2.2免疫組化取眼袋整形術后外眥處多余皮膚組織做免疫組化。采用SP法進行染色，組織經石蠟切片、3%H2O2甲醇水溶液室溫孵育10 min，正常山羊血清封閉10 min，加入ERα、ERβ抗體在濕盒中，室溫孵育1～2 h，滴加生物素二抗，DAB染色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯脫水，中性樹脂封片。鏡檢。表皮層采用半定量進行判定：（1）ERβ染色強度，無染色記0分，染色淺淡記為1分，黃色記為2分，棕黃色記為3分；ERα染色強度，無染色記0分，染色淺黃記為1分，黃色或黃褐色記為2分，深褐色記為3分。（2）陽性細胞計數。在400倍鏡下任意讀取5個視野，其中陽性細胞比例在5%以下為陰性，記0分，5%～25%計為1分，26%～ 50%計為2分，50%以上計為3分。（1）項和（2）項合計，0分為（-），1～2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）。

1.2.3聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）分析技術 （1）標本采集。分別抽取2組空腹肘正中靜脈血約6 mL，置于真空管中，標本放置于-80℃冰箱中保存備用。（2）引物合成。按照相關文獻［6］設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成。對于ERα基因特異性擴增PvuⅡ、XbaⅠ多態位DNA引物序列，即P1：5′-CGTAGCTTACGC?GCTGTACTACGCTACAGTCGCGGACTAGC-3′，P2：5′-TAGCGTCGTACGGCTTACGCGCCTACGCTCGCGA-3′，PCR產物片段的長度為1.4 kb；對于ERβ基因特異性擴增RsaⅠ、AluⅠ多態位DNA引物序列，即P3：5′-GCTCGACGGCTACG?TAAGCTACGACGTTAATTCGCGACGC-3′，PCR產物片段的長度為157 bp；P4：5′-CGTAGCTGTACTCGACGACAGCGCG?TATCGACGACAGGC-3′，PCR產物片段的長度為306 bp。（3）全血DNA提取。取含有EDTA抗凝血2 mL，用基因組DNA提取試劑盒（Promega公司，美國）提取DNA，保存于-40℃冰箱中備用。（4）PCR-RLFP檢測。對于ERα基因片段選擇的PCR擴增條件為反應總體系25 μL，其中含有血基因組DNA 0.1 μg，2×MasterMix 12.5 μL，引物各0.6 μmol/L，三蒸水9.5 μL，PCR擴增反應95℃預變性2.5 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸75 s，共計30個循環，最后采用72℃延伸4.5 min。對于ERβ基因RsaⅠ片段選擇的PCR擴增條件為反應總體系30 μL，其中含有血基因組DNA 0.15 μg，2×MasterMix 14.5 μL，引物各0.6 μmol/L，三蒸水10.5 μL，PCR擴增反應95℃預變性3 min，94℃變性30 s，70℃退火30 s，72℃延伸90 s，共計30個循環，最后采用73℃延伸4.5 min。對于ERβ基因AluⅠ片段選擇的PCR擴增條件為反應總體系25 μL，其中含有血基因組DNA 0.1 μg，2× MasterMix 12.5 μL，引物各0.6 μmol/L，三蒸水9.5 μL，PCR擴增反應95℃預變性2.5 min，95℃變性30 s，56℃退火45 s，73℃延伸60 s，共計30個循環，最后采用73℃延伸5 min。取PCR產物10 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外線透射儀觀察PCR擴增是否成功，鑒定其特異性。（5）限制性酶切分析ERα和ERβ基因。分別取PCR產物10 μL，采用12 U PvuⅡ、20 U XbaⅠ以及10 U RsaⅠ、AluⅠ于37℃酶切3.5 h，反應終止后所得產物經2%或3%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色25 min，紫外線透射儀觀察各基因片段的結果。使用PvuⅡ酶切分出3種基因，PP型終產物為1條帶（1 300 bp）、pp型終產物2條帶（分別在450 bp和850 bp）、Pp型終產物為3條帶（分別在450 bp、850 bp和1 300 bp），XbaⅠ酶切可以區分3種基因，即XX型終產物1條帶（1 300 bp）、xx型終產物2條帶（分別在310 bp和930 bp）、Xx型終產物為3條帶（分別在310 bp、930 bp和1 300 bp），其中P、X表示基因片段中出現點突變而導致酶切位點消失，p、x則存在該片段的酶切位點。

1.3統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件進行處理。等位基因頻率和基因型采用基因計算法統計，采用四格表χ2檢驗檢測研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度、單個基因型和各組間等位基因頻率，采用R×C列聯表χ2檢驗檢測不同組間ER基因頻率，采用比值比（OR值）和95%可信區間（95%CI）確定危險度，采用Spearman等級相關性分析ER免疫組化結果與黃褐斑嚴重程度的相關性。計數資料組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1免疫組化結果病例組部分真皮纖維細胞和血管內皮細胞中ERα和ERβ呈陽性表達，而對照組則表達較弱，見圖1。

A：對照組ERα表達；B：病例組ERα表達；C：對照組ERβ表達；D：病例組ERβ表達Fig.1　Immunohistochemical staining results（×400）圖1　免疫組化染色結果（×400）

2.2病例組ER蛋白表達與黃褐斑評分的關系病例組ERα和ERβ表達程度為（+）、（++）所占比例明顯高于其他各表達程度組。ERα和Erβ表達程度與黃褐斑評分均呈正相關（rs分別為0.462和0.512，P＜0.05），見表1。

Tab.1　The relationship between the expression of ER protein and the score of the yellow brown spot in the case group表1　病例組ER蛋白表達與黃褐斑評分的關系

2.3ERα和ERβ基因型分析ERα基因型分析，見圖2A。ERβ基因型分析，使用RsaⅠ酶切分出3種基因，rr型終產物為1條帶（156 bp）、Rr型終產物3條帶（分別在156 bp、125 bp和31 bp）、RR型終產物為2條帶（分別在125 bp和31 bp），見圖2B。AluⅠ酶切可以區分3種基因，即aa型終產物1條帶（307 bp）、Aa型終產物3條帶（分別在307 bp、240 bp和67 bp）、AA型終產物為2條帶（分別在240 bp 和67 bp），其中R、A表示基因片段中出現點突變而出現的酶切位點，r、a表示為野生型，不存在該片段的酶切位點，見圖2C。

2.42組中ERα和ERβ不同基因型的比較經Hardy-Weinberg平衡檢驗病例組和對照組各基因型達到遺傳平衡（P＞0.05），具有群體代表性，見表2。ERα基因PvuⅡ基因型在2組中分布差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。XbaⅠ基因型在2組中分布差異有統計學意義（P＜0.05），以xx基因型為參照，暴露于X等位基因（Xx+XX）的OR值為2.23，見表4。ERβ基因AluⅠ基因型在2組中分布差異有統計學意義（P＜0.05），以aa基因型為參照，暴露于A等位基因（AA+Aa）的OR值為1.58，見表5。RsaⅠ基因型在2組中分布差異有統計學意義（P＜0.05），以rr基因型為參照，暴露于R等位基因（RR+Rr）的OR值為2.37，見表6。

Fig.2　Electrophoresis results of ER alpha and ER beta genes圖2　ERα和ERβ基因分析電泳結果

Tab.2　Hardy-Weinberg balance test results of ER alpha and ER beta genes表2　ERα和ERβ基因的Hardy-Weinberg平衡檢測結果

Tab.3　ER alpha gene PvuⅡin control group and case group表3　對照組與病例組ERα基因PvuⅡ基因型

Tab.4　ER alpha gene XbaⅠin control group and case group表4　對照組與病例組ERα基因XbaⅠ基因型

Tab.5　ER beta gene AluⅠin control group and case group表5　對照組與病例組ERβ基因AluⅠ基因型

Tab.6　ER beta gene RsaⅠin control group and case group表6　對照組與病例組ERβ基因RsaⅠ基因型

3　討論

黃褐斑是臨床上較為常見的獲得性色素增加性皮膚病之一，在亞洲人群中其發病的部位多在下眼瞼、鼻根部以及面部顴頰處，該病發病率極高，且多發于中青年女性［7］。由于其發病的部位在面部，嚴重影響美觀，以致影響患者生活和工作的質量。黃褐斑的發生與機體內分泌失調、激素水平紊亂、激素注射以及睡眠質量不佳等有一定的關系。目前，ER在骨質疏松、腫瘤以及心血管疾病的發生發展中的作用已經明確。ER具有抑制皮脂腺分泌和促進黑色素細胞增殖的作用［8］。研究顯示，ERα、ERβ共同分布在皮脂腺單元中，發揮相互協同作用，還具有加深皮膚色澤促進黑色素細胞增殖的作用［9］。黑色素細胞通過酪氨酸-酪氨酸酶等一系列的生化反應形成黑色素，女性妊娠期、月經紊亂、性生活不協調以及精神狀態較為壓抑時，ER出現較大的變化，接觸谷胱甘肽或者硫氫基對酪氨酸的抑制作用，從而導致黑色素的增加。也有研究顯示，β-雌二醇可呈劑量依賴性增加酪氨酸酶活性。ER與黃褐斑的發生明確相關，其中ERβ與黃褐斑色素嚴重程度明確相關［10］。本研究除印證了ERβ與黃褐斑的發病有關，也初步證實ERα與黃褐斑的發病存在一定的關系。

基因多態性是人類基因組中一個較為常見的現象，機體基因片段的某些位點出現基因多態性則對基因的轉錄以及基因產物的表達、功能等均產生較大的影響。目前關于雌激素受體基因多態性與黃褐斑的發病關系研究報道較少［11］。有研究指出，ERα基因在1號內含子有兩處可發生突變，此處突變在限制性內切酶PvuⅡ的識別位點，另一處則在離PvuⅡ多態性位點50 bp處，可被限制性內切酶XbaⅠ識別［12］。不同基因型有可能決定不同個體之間ER的表達水平與功能差異。有研究顯示，ER水平高低與黃褐斑的發病無明顯關系［13］。本研究結果顯示，ERα基因XbaⅠ基因型、ERβ基因AluⅠ、RsaⅠ在對照組和病例組中分布差異有統計學意義。ERα基因XbaⅠ基因型中X等位基因是xx基因型的2.23倍，ERβ基因AluⅠ基因型中A等位基因是aa基因型的1.58倍，而RsaⅠ基因型R等位基因是rr基因型的2.37倍，這些說明X、A以及R等位基因可能是黃褐斑發病的易感基因。綜上，黃褐斑的發病與ERα基因XbaⅠ基因型、ERβ基因AluⅠ、RsaⅠ基因型多態性有關，突變基因增加了黃褐斑發病的風險，其中Xx、Aa和RR基因型易患病。

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（2015-11-06收稿2016-02-29修回）

（本文編輯魏杰）

中圖分類號：R758.4+2

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150292

The relationship between the incidence of melasma and estrogen gene polymorphism

BAI Zhao
Skin Surgery,The Affiliated Hospital of Tianjin Traditional Chinese Medicine Research Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300120,China

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between estrogen gene polymorphism and the incidence of melasma.MethodsA total of 56 patients with chloasma blepharoplasty surgery(case group)and 39 healthy women with eyelid blepharoplasty(control group)were included in this study.The expression of estrogen receptor(ER)was detected by immunohistochemistry.The ERα gene PvuⅡand XbaⅠrestriction site polymorphisms and RsaⅠand AluⅠrestriction sitepolymorphism of ERβ gene were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)analysis in two groups.The relationship between the incidence of ER and the score of melasma was analysed.ResultsResults of immunohistochemistry showed that there were positive expressions of ERα and ERβ in dermal fibroblasts and endothelial cells of case group,while there was weak expressions of ERα and ERβ in control group.Spearman correlation analysis showed that there was a positive correlation between ERα,ERβ and melasma score(rs=0.462 and 0.512,P＜0.05).There was a significant difference in distribution of ERα gene XbaⅠgenotype between two groups(P＜0.05).With xx genotype reference,the value of OR exposed to X allele(Xx+XX)was 2.23(95%CI:1.41-3.89,P＜0.05).There was a significant difference in ERβ gene AluⅠ genotypes between two groups(P＜0.05).With aa genotype reference,the value of OR exposed to the A allele(AA+Aa)was 1.58(95%CI:1.21-4.29,P＜0.05).There was a significant difference in RsaⅠgenotype distribution between two groups(P＜0.05).With reference rr genotype,the value of OR exposed to R allele(RR+ Rr)was 2.37(95%CI:1.19-6.33,P＜0.05).ConclusionThe incidence of melasma is related with XbaⅠERα genotype, ERβ gene AluⅠ,RsaⅠgenotype polymorphisms.The gene mutations increase the risk of incidence of melasma.Persons with Xx,Aa and RR genotypes are susceptible to melasma.

作者單位：天津中醫藥研究院附屬醫院皮膚外科（郵編300120）

作者簡介：白朝（1969），男，副主任醫師，博士，主要從事色素性皮膚病及臨床治療方面研究

Key words:melanosis;estrogen receptor alpha;estrogen receptor beta;polymorphism,genetic;chloasma