土壤微生物分離純化和分子鑒定實驗研究

吳秋芳，付　亮，路志芳（安陽工學院生物與食品工程學院，河南安陽455000）

土壤微生物分離純化和分子鑒定實驗研究

吳秋芳，付亮，路志芳
（安陽工學院生物與食品工程學院，河南安陽455000）

摘要：通過微生物學實驗項目“微生物分離純化和分子鑒定”的實施，在生物技術專業本科生中開展了土壤細菌的分離、純化和鑒定實驗。學生在老師的帶領下從太行山采集了土壤樣品，利用平板法進行了土壤中細菌、真菌和放線菌的分離、純化，對分離純化的細菌進行了16SrDNA序列分析，結果表明：該細菌為假單孢桿菌。學生通過野外采集土樣，實驗室分離純化的實驗過程，既鍛煉了學生的實驗動手能力，又培養了學生的學習興趣，激發了學生的學習熱情，加深了學生對微生物理論知識的理解，提高了學生的創新能力。

關鍵詞：土壤細菌；分離純化，分子鑒定；實驗教學

D01：10.19329/j.cnki.1673-2928.2016.04.010

微生物學實驗課是面向生物技術、生物科學、環境科學、食品、發酵和農林等專業的學生所開設的基礎實驗課，其教學目的是，通過微生物實驗的開展，幫助學生理解課堂基礎理論知識，掌握基本的實驗方法，提高學生的綜合能力的培養。通過長期的實驗教學的積累，將“土壤微生物分離純化鑒定”進行了凝練和總結，建立了綜合性實驗項目“土壤細菌分離純化和分子鑒定”，通過對土壤樣品處理中微生物純化分離與培養實驗的研究與探索，豐富了生物技術專業的微生物實驗項目的教學內容，使學生掌握了微生物學的基本實驗操作技能，了解了微生物學的基礎理論知識，加深了學生對課堂理論基礎知識的理解，培養了學生觀察、思考和分析問題的能力，提高了學生解決問題的能力，激發了學生的勇于開拓創新的精神，達到了培養應用型人才的目的［1-3］。

1土壤細菌分離純化實驗

微生物實驗主要包括環境微生物的檢測和菌落識別、各類微生物的形態觀察，生長繁殖的測定，菌種的分離、培養、鑒定和保藏等內容［4］。根據實驗教學的特點，設計了微生物綜合實驗“土壤微生物分離純化鑒定”實驗，實驗內容有若干實驗組成，所有實驗均為微生物基礎性實驗，學生在老師的指導下進行。

1.1實驗準備工作

1.1.1土壤樣品采集

樣品采集時間為2015年6月1日，地點在太行山大峽谷（E113.514587，N35.640880，海拔：1251.20），裝入事先準備好的無菌牛皮袋中，帶回實驗室［5］，放入4℃冰箱保存備用。

1.1.2土壤菌懸液的制備

稱取鮮土樣于盛有滅菌的無菌水的培養瓶（事先放好無菌的玻璃珠）中，室溫下在搖床上充分振蕩，然后逐級稀釋成不同稀釋度待用。

1.1.3培養基的配制

不同微生物的分離培養使用不同的培養基種類。1）細菌培養使用牛肉膏蛋白胨培養基，pH調為7；2）真菌培養使用PDA培養基，pH自然；3）放線菌培養使用高氏一號培養基，pH調為7。

1.1.4實驗用品的包裝

實驗所用培養皿5個一捆用報紙包好用橡皮筋扎好，錐形瓶用封口膜封口用橡皮筋扎緊，不同規格的槍頭裝槍頭盒中，待滅菌后使用。

1.1.5滅菌

將配制好的培養基和實驗用品以及純凈水在121℃滅菌20min，之后放烘箱烘干待用。

1.2土壤微生物的分離純化

將滅菌的培養基制成平板，待平板冷卻后，將土壤菌懸液10-2、10-3涂平板后進行放線菌的形態觀察培養，將土壤菌懸液10-4、10-5涂平板后進行真菌形態的觀察培養，將土壤菌懸液10-6、10-7涂平板后進行細菌的形態觀察培養，倒置于30℃恒溫培養箱內，細菌培養48h，真菌和放線菌培養培養168h觀察菌落長勢，挑單菌落進行分離純化3～4次，得到細菌純種。

1.3土壤微生物的形態觀察

在分離純化的微生物菌株中，將分離純化后的一株細菌進行形態特征的觀察，記錄單菌落的形態特征，并使用萊卡顯微鏡進行細菌形態的觀察，作為鑒定菌株的依據。圖1為分離純化的一株細菌菌株在牛肉膏蛋白胨培養基平板上的菌落，圖2為萊卡顯微鏡下該細菌菌株的形態特征。

圖1：細菌菌落形態

圖2：細菌細胞形態（萊卡顯微鏡下觀察結果）

1.4土壤微生物的生理生化特征的觀察

將上述分離純化的細菌進行革蘭氏染色、芽孢染色和莢膜染色，明膠反應。

圖3為分離純化的細菌的革蘭氏染色反應結果。

圖3：細菌革蘭氏染色結果（萊卡顯微鏡下觀察結果）

1.5細菌16S rDNA全序列的測定

將上述分離純化的這株細菌進行16S rDNA全序列的測定。

1）DNA提取：基因組抽提盒（TAKARA）。

2）16SrDN擴增：以細菌通用引物 F27（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和R14.2（5'-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）（引物均由上海杰里生物技術有限公司合成）擴增細菌16SrDNA，擴增片斷長度大約是1.5 kbPCR產物；

3）目的片段膠回收。膠回收試劑盒（TAKARA）；

4）連接到pMD19-T載體；

5）轉化到大腸桿菌TJP10；PCR鑒定陽性轉化子；

6）測序（上海杰里生物技術有限公司）。

1.6細菌16S rDNA序列分析結果

將分離純化的一株細菌16S rDNA的全序列與NCBI數據庫中參考數據進行比對，發現與假單胞菌基因序列相似性為99%，因此初步判斷該細菌為假單胞桿菌。

爺爺奶奶照看孫女，因索要“帶孫費”，與兒子兒媳對簿公堂，山東淄博市博山區人民法院日前經過審理認為，爺爺奶奶幫兒子媳婦帶孫子非法定義務，因此索要“帶孫費”的要求合情合理合法，予以支持。

2土壤微生物分離純化實驗效果

2.1豐富的實驗內容激發了學生的學習積極主動性

本項目的土壤微生物的分離純化實驗內容包括了野外土樣的采集，細菌、真菌和放線菌的分離純化、形態觀察、生理特征的觀察、菌落計數和分子鑒定等內容，實驗內容豐富，開闊了學生的視野，增長了學生的見識。通常基礎微生物實驗教學內容主要以細菌為實驗對象開展教學，學生因此對細菌的認識較深，而對于真菌和放線菌的認識更多地停留在概念上，印象較為模糊，通過本實驗的實施，使學生對細菌、真菌和放線菌的認識進一步加深，了解不同微生物種類分離需要使用不同的培養基，而且培養基的PH還直接影響到微生物的分離效果，尤其是放線菌的分離對培養基的種類和PH要求更高。豐富的實驗教學內容使學生進一步對微生物世界有了新的認識，微生物原來這么漂亮，種類這么多，其直觀、鮮明的圖案可勾起學生的強烈興趣，促進了學生的學習熱情，使枯燥的理論知識在學生心中升華，促進了學生把理論知識轉化成實踐知識的動力，奠定了科研型和應用型人才的培養基礎［6-8］。

2.2野外土樣采集開闊了學生的視野

學生在老師的帶領下，到太行山大峽谷采集了野外土壤樣品，土壤中有多種多樣的微生物種類，其野外采集過程開闊了學生的視野，采集之前的準備環節和采集過程的操作，更使學生明白實驗結果的獲得與整個實驗過程有著緊密的聯系，實驗過程的諸多細節對實驗的結果有著重要的影響。

2.3實驗方法的多樣化培養了學生嚴謹的實驗態度

土壤樣品中微生物的種類多種多樣，將不同微生物從土壤中分離出來，需要多個實驗步驟，每個步驟都需要若干準備環節組成，為了獲得不同的微生物菌株，選擇了不同的培養基，甚至在培養基中加入了氯霉素等抗生素，來抑制不同雜菌的生長，就是這么嚴謹的實驗操作，學生做出的平板中細菌中混有真菌，真菌中混有細菌。為了進一步純化微生物菌株，學生做實驗更加認真，對微生物進行了多次劃線分離后終于得到了純菌落，這個實驗項目著實培養了學生嚴謹的實驗態度，鍛煉了學生的動手操作能力，培養了學生了創新的能力［9-11］。

2.4分子生物學知識激發了學生的求知欲

3結語

土壤微生物分離純化與培養實驗項目屬于綜合性實驗，有多個實驗組成，系統的把原本孤立的實驗聯系起來，包括了野外土壤樣品的采集，實驗儀器的使用、實驗器皿的包裝、實驗試劑的配制等，每個實驗環節都讓學生參與，鍛煉了學生的實驗操作基本技能，提高了學生學習的積極主動性，豐富了實驗教學內容，激發了學生的學習興趣，培養了學生的創新思維，提升了實驗教學水平，促進了我校微生物實驗教學的發展。

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（責任編輯：郝安林）

中圖分類號：Q93-3

文獻標志碼：A

文章編號：1673-2928（2016）04-0027-03

收稿日期：2015-12-08

基金項目：安陽工學院校級基金項目（YJJ2015011）。

作者簡介：吳秋芳（1974-）女，河南安陽人，副教授，在讀博士，研究方向：環境微生物。

Purification and Molecular Identification Experiments of Microbe in Soil

WU Qiufang，Fu Liang，LU Zhifang
（School of Biological and Food Engineering，Anyang Institute of Technology，Anyang，455000，China）

Abstract:With the progress of the microbe experimental project，"purification and molecular identification experiments of microbe"，the purification and molecular identification experiments of bacteria in soil were conducted by biotechnology majors.The students went to Taihang Mountains to collect soil samples and isolated the bacteria，fungi and actinomycetes from the soil and purified the bacteria by using pour plate method and streak plate method.The purified strain was preliminarily identified as Pseudomonas according to the analysis of its 16s rDNA sequence.Students through the field to collect soil samples，the separation，purification of lab experiment process and their practical ability was cultivated and their develop the students'interest in learning enthusiasm in leaming was stimulated.In addition，not only was students'understanding of the basic theoretical knowledge of micrology enhanced but also their creative adility were promoted.

Key words:in soin；isolation and purification；molecular identification；experiment