復方白鮮皮抗菌凝膠劑的制備及質量控制

周愛媚，汪 妍，方圓圓，陳 菲

（金華職業技術學院，浙江 金華 321007）

復方白鮮皮抗菌凝膠劑的制備及質量控制

周愛媚，汪 妍*，方圓圓，陳 菲

（金華職業技術學院，浙江 金華 321007）

目的 制備復方白鮮皮抗菌凝膠劑，并用高效液相（HPLC）法測定復方白鮮皮抗菌凝膠劑中白鮮堿的含量。方法 以白鮮堿為指標成分控制含量，用閃式提取法提取白鮮皮和苦參混合物濃縮液，確定了以1.0%卡波姆-940、1.0%冰片、10%甘油、5%乙醇、0.2%聚山梨酯80、0.1%羥苯乙酯、1.35%三乙醇胺為處方組成，通過外觀和穩定性觀察實驗確定復方白鮮皮抗菌凝膠劑制備工藝。結果 凝膠劑外觀性狀為淡黃色晶瑩透明狀膠體，氣微清香；pH值約為6.7；穩定性試驗表明本品各指標均無明顯改變，皮膚刺激性試驗表明本品對皮膚無明顯刺激，手足癬主要致病真菌的抑菌試驗表明該制劑對皮膚表面自然菌的除菌率為71.8%。結論 本制備方法簡便可行，分析方法可用于控制白鮮皮抗菌凝膠劑中有效成分的含量。

復方白鮮皮抗菌凝膠劑；制備；質量控制

白鮮皮為蕓香科白鮮屬植物白鮮Dictamnus dasycarpus Turcz.的干燥根皮，是一種常用中藥，為歷代本草及《中國藥典》收載。白鮮皮屬于多年生草本，根皮外表面呈淡灰黃色、內表面類白色，肉質脆，味微苦，寒。具有清熱燥濕、祛風止癢、解毒之功效，臨床上用于治療濕熱瘡毒、濕風疹、疥癬瘡癩、風濕熱痹、神經性皮炎等慢性頑固性皮膚病[1]等，并對心血管及血液病有一定療效，特別是對皮膚類疾病有很好的治療作用，如對皮膚瘙癢，濕熱瘡瘍，陰部腫痛等病癥都有一定的功效。化學研究表明，其中的白鮮堿和梣酮是主要有效成分，具有顯著活性[2]。目前西醫臨床上主要用抗真菌軟膏類藥物來治療手足癬，但由于合成的抗真菌藥物不良反應多，易產生耐藥性，還有一定的毒副作用，真菌感染治療仍然面臨許多挑戰[2]。鑒于中藥副作用小，來源廣，價格低廉，較少出現耐藥性，因此從天然藥物中尋找安全性好、抗菌譜廣、療效高的抗真菌抗細菌成分已成為重要的研究方向[3]。因而本實驗篩選出具有清熱祛濕、涼血解毒、殺蟲止癢等功效的中藥白鮮皮和苦參作為復方藥材，以白鮮堿為指標成分提取其濃縮液，并將復方白鮮皮濃縮液制備為凝膠劑[4]。本文經過對復方白鮮皮進行高效液相（HPLC）法含量控制，驗證其有效成分的含量，從而促進復方白鮮皮抗菌凝膠劑的臨床應用。

1儀器與試藥

1.1儀器

閃式提取器（河南金鼎科技發展有限公司）、F1004型電子天平（上海天平儀器廠）、高速藥材粉碎機（浙江金華華盛實業有限公司）、HH-6數顯恒溫水浴鍋（常州恒德儀器制造有限公司）、BC-R501旋轉蒸發儀（上海盛玻儀器有限公司產品）、Waters2487高效液相色譜儀、2487紫外分光檢測器、Breeze色譜工作站、DHP-9052型電熱恒溫培養箱（上海和呈儀器制造有限公司）、LDZX-75KBS高壓滅菌器（上海楚柏實驗室設備有限公司）、凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、酸堿測試儀、研缽等。

1.2試劑

白鮮皮、苦參（購自金華三溪堂國藥館）、甘油、卡波姆-940（青島美生源生物科技有限公司）、乙醇（深圳市天時化工有限公司）、聚山梨酯80（上海山浦化工有限公司）、三乙醇胺（上海化學試劑有限公司）、稀鹽酸（無錫陽山生化有限責任公司）、羥苯乙酯（上海山浦化工有限公司）、冰片（天津市化學試劑公司）、色譜級甲醇（北京京科瑞達有限公司）、去離子純化水等。金黃色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、石膏樣小孢子菌（Microsporum gypseum）、犬小孢子菌（Microsporum canis）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）、須癬毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes）、絮狀表皮癬菌（Epidermophyton floccosum）由金華職業技術學院基礎醫學實驗中心提供。

1.3對照品

白鮮堿標準品（購自中國藥品生物制品鑒定所）。

2方法與結果

2.1復方白鮮皮濃縮液制備

將白鮮皮和苦參（3∶1）打碎磨粉后稱取40 g于閃式提取器中，以1∶10的料液比加入80%的乙醇溶液，提取電壓為60 V，提取時間為2 min，過濾，收集濾液，濃縮和真空冷凍干燥，用80%乙醇溶解并定容至200 mg.ml-1備用。取復方白鮮皮提取液200 ml（白鮮皮∶苦參=3∶1），用旋轉蒸發儀旋轉蒸發除去溶劑，遺留殘渣加80%乙醇液20 ml溶解，過濾，濾液用80%乙醇定容至20 ml，制成每1 ml含2 g藥材的溶液。

2.2凝膠劑的制備

2.2.1凝膠基質處方基質處方組成：卡波姆-940[5，6]1.0 g，甘油10 g，乙醇5 g，聚山梨酯80 0.2 g，羥苯乙酯0.1 g，三乙醇胺1.35 g，蒸餾水加至100 ml。

制備方法：將卡波姆-940播撒入甘油表面，用研磨法使其充分浸潤完全后，再加10 ml蒸餾水研磨細膩，加50 ml水，使之充分溶脹。將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于5 ml水后加入上液研磨，再將羥苯乙酯溶于乙醇逐漸加入攪勻，加蒸餾水至全量，攪拌均勻即得。

結果觀察：呈膠凍狀，透明清亮細膩，光澤度好，長時間放置穩定。

2.2.2復方白鮮皮凝膠劑制備（1）處方設計：冰片[7]1.0 g，復方白鮮皮濃縮液5 ml，卡波姆-940 1.0 g，甘油10 g，乙醇5 g，聚山梨酯80 0.2 g，羥苯乙酯0.1 g，三乙醇胺1.35 g，蒸餾水加至100 g。

（2）制備工藝的優化。制備方法一：將卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面，用研磨法使其充分浸潤完全后，加入復方白鮮皮濃縮液5 ml和5 ml溶有冰片和羥苯乙酯的乙醇溶液；再加50 ml蒸餾水研磨細膩，使之充分溶脹；將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨，再加蒸餾水至全量，攪拌均勻即得。

制備方法二：將卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面，用研磨法使其充分浸潤完全后，加10 ml蒸餾水使之充分溶脹；加入復方白鮮皮濃縮液5 ml和5 ml溶有冰片和羥苯乙酯的乙醇溶液，再加40 ml蒸餾水研磨細膩；將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨，再加蒸餾水至全量，攪拌均勻即得。

制備方法三：將卡波姆-940 1.0 g播撒入10 g甘油表面，用研磨法使其充分浸潤完全后，再加50 ml蒸餾水研磨細膩，使之充分溶脹；將三乙醇胺、聚山梨酯80溶于10 ml水后加入上液研磨；加入復方白鮮皮濃縮液5 ml和5 ml溶有冰片和羥苯乙酯的乙醇溶液，再加蒸餾水至全量，攪拌均勻即得。

2.2.3結果考察（見表1）通過對3個成品進行外觀性狀觀察和長時間放置穩定性觀察兩個指標確定制備方法的優劣，經過綜合評價，制備方法二被篩選為實驗最佳制備方法。

表1 各制備方法考察結果

2.3凝膠劑含量測定

2.3.1色譜條件色譜條件：以Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以甲醇—水（V/V=70∶30）為流動相；流速：0.5 ml/min；柱溫25℃；檢測波長：237 nm；靈敏度：0.5AUFS；進樣量：20 μl。理論塔板數以白鮮堿計不低于5 000。

2.3.2供試品溶液的制備 取凝膠劑樣品5 g，精密稱定，置于50 ml錐形瓶中，加流動相（甲醇∶水=70∶30）約15 ml，超聲20 min，放置至室溫，轉移至25 ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度。搖勻，離心10 min，取其上清液過0.45 μm濾膜，取續濾液作為供試品溶液。

2.3.3對照品溶液的制備 稱取白鮮堿標準品適量，置于100 ml容量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.664 mg/ml的白鮮堿對照品溶液。

2.3.4測定方法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3.5標準曲線及線性范圍 精密吸取白鮮堿對照品用流動相依次稀釋定容，配制成1.05、4.2、8.4、16.8、33.2、66.4 μg·ml-1系列濃度，分別進樣，以白鮮堿對照品質量濃度X對白鮮堿色譜峰面積Y做標準曲線，得回歸方程分別為：y=740 444.85x+ 2 265 470.91，r2=0.999 3（n=6）。即呈良好線性關系。

2.3.6精密度試驗 精密吸取對照品溶液20 μl，注入高效液相色譜儀，連續測定5次，記錄峰面積積分值，并以峰面積計算RSD值。結果表明，該儀器精密度良好，可靠性強。

2.3.7穩定性試驗 精密吸取復方白鮮皮抗菌凝膠劑供試品溶液20 ul，按照上述色譜條件分別于0、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h進樣，測定峰面積，并以峰面積計算RSD值。結果表明，供試品溶液在24 h基本穩定，RSD值為2.54%。

2.3.8重復性實驗 精密吸取同一供試品溶液20 μl，依法測定，重復測定5次。結果表明5批樣品的白鮮堿含量平均為8.8 μg/g，RSD為1.57%。

2.3.9回收率試驗 精密稱取復方白鮮皮抗菌凝膠劑3批次樣品各1份，每份分別加入白鮮堿對照品溶液適量，制備成高、中、低3個濃度各3份，計算每個濃度的平均加樣回收率，平均回收率103.85%，RSD=2.24%（n=3），說明方法回收率良好。

2.3.10樣品含量測定 精密吸取供試品溶液20 μl，進樣測定，3批樣品中白鮮堿的平均含量為8.75 μg/g，結果見表2。

表2　各批號樣品含量測定結果（μg/g）

2.4皮膚刺激性試驗

2.4.1方法 選用健康家兔4只，體重在4.0～5.0 kg之間，在給藥前24 h將兔背部脊柱兩側對稱脫毛（每側大約5 cm×5 cm）。以每只兔子左邊為試驗組，右邊為對照組。每次在背脊右側涂空白凝膠劑0.3 g，背脊左側涂含藥凝膠劑0.3 g，每日重復給藥2次，連續給藥1周，觀察皮膚變化。

2.4.2實驗結果 觀察比較對照組和試驗組在給藥過程中及給藥1周內的皮膚情況。結果表明基本無發生皮膚紅斑及水腫現象，說明本制劑對皮膚基本無刺激。

2.5穩定性試驗

2.5.1離心試驗 取凝膠劑樣品10 g，裝入離心試管中，以2 500 r/min轉速離心20 min，結果凝膠劑未出現分層和沉淀現象。

2.5.2耐熱試驗 取凝膠劑樣品10 g，置于60℃恒溫水浴放置6 h，結果凝膠劑未出現分層和沉淀現象。

2.5.3耐寒試驗 取凝膠劑樣品10 g，置于-15℃冰箱放置24 h，結果凝膠劑未出現分層及凍結現象。

2.6抑菌試驗

2.6.1懸液定量法 吸取樣品凝膠劑原液放入5.0 ml的滅菌試管中，20℃恒溫5 min。吸取試驗菌液（濃度約為1×104～9×104cfU/ml）0.1 ml加入到凝膠劑樣品中，迅速混勻，并立即計時，作用至30 min后，取試驗菌與樣品混合液1 ml，加入到含5.0 ml經滅菌的PBS試管中，充分混勻。置10 min后，吸取混勻后的樣液1 ml，置于滅菌平皿內，每個樣液接種兩個滅菌平皿。用涼至40℃~45℃的培養基15 ml做傾注，轉動平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉平皿，當試驗菌是金黃色葡萄球菌或綠膿桿菌時，置37℃恒溫箱培養16～18 h；當試驗菌是紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣小孢子菌或犬小孢子菌時，置26℃恒溫箱培養7天，做活菌菌落計數；以PBS代替試驗樣品，同時按以上步驟操作，作為對照樣品，實驗重復3次，求其平均值。

抑菌率=（對照樣品平均菌落數—試驗樣品平均菌落數）÷對照樣品平均菌落數。

懸液定量法結果表明：復方白鮮皮抗菌凝膠劑對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抑菌率均在70%以上。

根據國家標準，抑菌率大于50%的抑菌型制劑屬于B2級以上級。說明復方白鮮皮抗菌凝膠劑抑菌試驗均達到了國家QBT2850-2005抑菌型制劑抑菌標準。

2.6.2使用前后菌落數比較試驗隨機選定40名足癬患者志愿受試者。采樣者用無菌棉拭子在含有10 ml無菌蒸餾水試管中浸濕，在左腳指屈面從指尖到指根往返涂擦2遍采樣，作為使用復方白鮮皮抗菌凝膠劑前對照。用無菌棉拭子蘸取復方白鮮皮抗菌凝膠劑對左腳指屈面從指尖到指根往返涂擦2遍進行擦拭，作用5 min，用無菌棉拭子按上述方法進行采樣，作為試驗組樣本。對所有采樣標本經充分振蕩洗脫，取洗脫液進行培養和菌落計數，計算自然菌減少對數值。結果表明：使用前志愿受試者腳上平均菌落數為195 cfu/cm2，用復方白鮮皮抗菌凝膠劑后，腳上殘存的平均菌落數為55 cfu/cm2，說明用該凝膠劑對皮膚表面自然菌的除菌率為71.8%。

3小結

（1）采用現代提取工藝80%乙醇閃式提取白鮮皮的抗菌成分，與傳統的水煎法相比，有提取完全、濃縮方便、藥液不易發霉等優點；與回流提取法相比，有提高提取效率、縮短提取時間、減少溶劑使用量等優點。

（2）本研究結合臨床和民間治療手足癬的經驗，篩選出治療手足癬的中藥復方制劑。中藥白鮮皮多制成洗液或者乳劑進行使用，而制成凝膠制劑的甚少。凝膠劑制備操作簡單，生產成本低。

（3）目前市場上個人洗護產品很多，但據調查對手部和足部癬菌有一定治療作用的護理產品幾乎沒有。而本制劑能克服西藥產生耐藥性及有一定毒副作用的弊端，有較好的治療作用，且安全、方便，能滿足消費者追求產品綠色化與安全的消費心理，有產生巨大經濟效益的前景。

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[3]張芳芳，張軍東，曹永兵，等.天然產物中抗真菌成分研究進展[J].國外醫藥（植物藥分冊），2003，18（5）：189.

[4]方和桂.適用于中藥外用的劑型——凝膠劑[J].藥學專論，2002，11 （8）：25-26.

[5]錢杰人.卡波姆凝膠劑及其應用[J].中國藥業，2003，12（6）：77.

[6]李晏，楊延莉，鄒豪，等.卡波姆及其在藥劑學上的應用[J].解放軍藥學學報，2008，8（2）：92-93.

[7]李東曉，鄧文龍.冰片促透作用研究進展[J].中藥藥理與臨床，2007，23 （1）：87-89.

（*通訊作者：汪妍）

R944.1+5

B

1671-1246（2016）13-0094-03

注：本文系2015年浙江省大學生科技創新活動計劃暨新苗人才計劃項目（2015R468001）