枸杞多糖含量測(cè)定方法的比較分析

李良，金文娟（武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430070）

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枸杞多糖含量測(cè)定方法的比較分析

李良，金文娟
（武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430070）

摘要：利用紫外分光光度計(jì)，采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)比苯酚-硫酸法（方法Ⅰ）、《中國(guó)藥典》中方法（方法Ⅱ）及改進(jìn)后的苯酚-硫酸法（方法Ⅲ），在485nm處測(cè)定枸杞多糖的含量，比較3種方法的優(yōu)劣。試驗(yàn)表明：3種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.930 9、0.991 8、0.996 8；吸光值穩(wěn)定性RSD值分別為10.95%、2.13%、0.13%；回收率試驗(yàn)中方法Ⅲ的相對(duì)誤差較小，無(wú)顯著差異。可見(jiàn)方法Ⅲ最優(yōu)。

關(guān)鍵詞：枸杞多糖；分光光度計(jì)法；比較分析

枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide）是從枸杞子中提取的一種水溶性多糖，具有降血脂、降血糖、保肝、抗腫瘤、抗衰老等多種生理功能［1-2］，其含量常作為評(píng)價(jià)某些中藥材及中藥制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)［3］；羅瓊等［4］以純枸杞多糖研究表明其顯示出比粗枸杞多糖有更明顯的免疫增強(qiáng)效應(yīng)；王柏昆等［5］實(shí)驗(yàn)證明10 mg/kg枸杞多糖對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率達(dá)31%；衣艷君［6］發(fā)現(xiàn)，枸杞子多糖能有效降低高脂血癥大鼠血清中TC含量，具有明顯的降血脂功能，調(diào)節(jié)脂類代謝的功能；陳立群等［7］研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的枸杞多糖能夠使鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠受損胰島β細(xì)胞得到恢復(fù)，胰島素分泌增加，血糖濃度降低，對(duì)STZ所致糖尿病大鼠具有較好的治療作用。邊綸等［8］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枸杞多糖對(duì)四氯化碳引起的肝損傷有修復(fù)作用，并促進(jìn)肝細(xì)胞再生。

枸杞多糖由于具有重要的生物學(xué)功能，因此，多糖的檢測(cè)方法也備受關(guān)注。付艷麗等［9］針對(duì)枸杞多糖含量進(jìn)行研究，于室溫下反應(yīng)15 min后，靜置于室溫，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定枸杞多糖含量；《中國(guó)藥典》中枸杞多糖含量的測(cè)定方法是：于40℃水浴中保溫15 min后，靜置至室溫后，在490 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)；任一平［10］對(duì)香菇多糖產(chǎn)品簡(jiǎn)易預(yù)處理，選用硫酸鈉溶液作為流動(dòng)相，在示差折光檢測(cè)器下檢測(cè)，選擇右旋糖酐為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用外標(biāo)法完成了香菇多糖的含量測(cè)定。

本文中枸杞多糖的測(cè)定方法采用苯酚-硫酸法。利用紫外分光光度法測(cè)定其含量，《中國(guó)藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)［11］均有此方法的記載，但經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，其吸光值極不穩(wěn)定，給標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和后期定量測(cè)定帶來(lái)困難。本試驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)［11］中枸杞多糖的檢測(cè)方法，對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)終止方法進(jìn)行優(yōu)化，以標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)，吸光值的穩(wěn)定性及回收率的比較，得到最佳的試驗(yàn)方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

枸杞多糖提取物：枸杞多糖含量30%、50%，西安和霖生物有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：HPLC≥98%，中國(guó)生物制品檢定所；苯酚、濃硫酸：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；ME3002E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)原理

本試驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)枸杞多糖的含量。苯酚-硫酸法由Dubois等［12］建立，其原理是利用濃硫酸將多糖水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，再和苯酚縮合成有色化合物，用紫外分光光度法測(cè)定其含量。此法靈敏度高、顯色較穩(wěn)定，是枸杞多糖最常用的檢測(cè)方法。但由于對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)終止方法缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，《中國(guó)藥典》及各文獻(xiàn)記載［13-14］的處理方法也不盡相同，本試驗(yàn)研究了不同的處理方式對(duì)多糖含量測(cè)定結(jié)果的影響，其中方法Ⅰ參照文獻(xiàn)［11］，方法Ⅱ根據(jù)《中國(guó)藥典》中的方法［3］，方法Ⅲ是改進(jìn)的方法。

苯酚-硫酸法（方法Ⅰ）：添加完濃硫酸后，室溫反應(yīng)15 min后，靜置至室溫后，紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)下進(jìn)行檢測(cè)。

《中國(guó)藥典》測(cè)定方法（方法Ⅱ）：參照《中國(guó)藥典》中枸杞多糖含量的測(cè)定方法，添加完濃硫酸后，置40℃水浴中保溫15min，取出，靜置至室溫后進(jìn)行檢測(cè)。

改進(jìn)苯酚-硫酸法（方法Ⅲ）：添加完濃硫酸后，沸水浴中反應(yīng)15 min，取出立即進(jìn)行冰水浴（水溫0℃左右），冷卻至室溫后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2枸杞多糖溶液的配制

稱取40 mg枸杞多糖50%的提取物于50 mL燒杯中，加水溶解，定容至100 mL，搖勻備用。

1.2.3溶液的配制

1.2.3.15%苯酚溶液的配置

60℃水浴使苯酚溶解，加少量蒸餾水隔絕空氣，精密吸取苯酚溶液5 mL至100 mL棕色容量瓶中，加水定容至刻度。

1.2.3.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取105℃烘至恒重的葡萄糖對(duì)照品50 mg 至100 mL小燒杯中，加適量水溶解，移至500 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含無(wú)水葡萄糖0.1 mg）。

1.2.4最佳吸收波長(zhǎng)掃描

以10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品為樣品，用方法Ⅱ中處理方法，在波長(zhǎng)為400 nm～800 nm間做全波長(zhǎng)掃描，與文獻(xiàn)報(bào)道［11］的枸杞多糖測(cè)定的最大吸收波長(zhǎng)490 nm左右作對(duì)比，確認(rèn)其最大吸收波長(zhǎng)。

分別吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL葡萄糖對(duì)照品溶液，注為0#、1#、2#、3#、4#、5#，補(bǔ)水至2.0 mL，加5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速垂直加入5.0 mL濃硫酸，振蕩5 min后，按照3種不同的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及不同的反應(yīng)終止方法進(jìn)行處理，在最大吸收波長(zhǎng)下，用紫外分光光度法測(cè)其吸光值，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6吸光值穩(wěn)定性的比較

為了檢驗(yàn)3種不同的處理方法對(duì)吸光值的穩(wěn)定性。分別以3種方法中5#（10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品）為試驗(yàn)樣品，每隔30 s測(cè)定一次吸光值，共測(cè)定10次，計(jì)算其RSD值，比較3種方法吸光值的穩(wěn)定性。

1.2.7回收率測(cè)定

用方法Ⅲ中的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)已知含量為30%、50%的枸杞多糖及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）進(jìn)行測(cè)定。每組樣品平行檢測(cè)6次，計(jì)算其平均值與相對(duì)誤差。

2　結(jié)果與討論

2.1最佳吸收波長(zhǎng)確定

根據(jù)文獻(xiàn)資料［11］及枸杞多糖檢測(cè)試驗(yàn)原理可知，反應(yīng)形成的顯色化合物在490 nm左右的波長(zhǎng)下有最大吸收值，通過(guò)對(duì)400 nm～800 nm做全峰值掃描級(jí)峰值檢測(cè)，掃描圖譜如圖1所示。

一個(gè)月后，出差回來(lái)的郭啟明打開(kāi)電腦上網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)有人在QQ上給自己留言：“沒(méi)有想到風(fēng)度翩翩的郭總還稀罕老婆？如果你樂(lè)意的話，我就湊合湊合吧！”這樣的直白和挑釁，讓郭啟明頓時(shí)產(chǎn)生了莫名其妙的好感。她到底是誰(shuí)呢？哪有女孩子這么主動(dòng)的？他不禁想與這個(gè)女孩說(shuō)說(shuō)話。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)最佳吸收波長(zhǎng)掃描圖Fig.1　Optimum absorption wavelength scan of glucose standard reaction

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)品在485 nm下有最大吸收波長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)比文獻(xiàn)資料［11］所述最大吸收波長(zhǎng)在490 nm左右，可知，最大吸收波長(zhǎng)為485 nm。

2.2多糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)品在同種濃度下，用3種不同的方法處理后，所檢測(cè)的吸光值見(jiàn)表1。

表1　3種方法濃度及吸光值Table 1　Concentration and absorbance value of three methods

由表1可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品在同種濃度下，3種方法所得的吸光值不同。其中方法Ⅲ所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.049 3x+0.014 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，相關(guān)系數(shù)最高，回歸性最好。

2.3三種方法吸光值穩(wěn)定性的比較

以10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品為樣品，用3種方法分別在不同時(shí)間測(cè)定其吸光值，每隔30 s測(cè)定一次，共測(cè)定10次，比較3種方法吸光值的穩(wěn)定性，計(jì)算其RSD值，見(jiàn)表2。

圖2　采用方法Ⅲ得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　The standard curve using by methodⅢ

表2　3種方法吸光值穩(wěn)定性的比較Table 2　Light absorption value stability comparison of the three methods

以葡萄糖為對(duì)照品，采用苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量時(shí)最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是反應(yīng)后的顯色。有報(bào)道認(rèn)為，影響顯色的重要因素是水浴溫度和水浴放置時(shí)間［15-16］。

通過(guò)3種顯色處理方法結(jié)果可知，根據(jù)《藥物分析》中要求，重復(fù)性儀器精密度中紫外RSD值≤5%，方法精密度RSD值≤3%，根據(jù)RSD值比較可知：

方法Ⅰ于室溫下靜置，反應(yīng)進(jìn)行不完全，吸光值穩(wěn)定性較差，因而對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制也有較大影響，曲線相關(guān)系數(shù)也較差。

方法Ⅱ雖然是《中國(guó)藥典》中引用的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是筆者在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于反應(yīng)后快速檢測(cè)，并沒(méi)有進(jìn)行冰水浴，所以并沒(méi)有對(duì)反應(yīng)進(jìn)行終止，也會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。

而筆者改進(jìn)過(guò)的方法Ⅲ采用沸水浴加熱，因其能促使縮合反應(yīng)更為完全，反應(yīng)后立即進(jìn)行冰水浴及時(shí)終止反應(yīng)，由于其吸光值趨于穩(wěn)定，變化幅度較小，曲線相關(guān)系數(shù)也較好。

三種方法吸光值趨勢(shì)圖見(jiàn)圖3。

圖3　三種方法吸光值趨勢(shì)圖Fig.3　Light absorption value trend graph of the three methods

根據(jù)圖3三種方法吸光值趨勢(shì)圖也可看出，方法Ⅲ的吸光值最為平穩(wěn)，變化幅度小，穩(wěn)定性較好。

2.4回收率測(cè)定

回收率的測(cè)定見(jiàn)表3。

表3　回收率的測(cè)定Table 3　Test of recovery

用方法Ⅲ中的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)已知含量為30%、50%的枸杞多糖及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）進(jìn)行測(cè)定，檢驗(yàn)其準(zhǔn)確性，由6次平行試驗(yàn)，得平均值為分別為30.03%、50.05%、98.21%，相對(duì)誤差分別為0.10%、0.04%、0.21%，說(shuō)明由方法Ⅲ得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)多糖含量的測(cè)定具有較好的準(zhǔn)確性。

3　結(jié)論

利用紫外分光光度計(jì)，采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)比方法Ⅰ、方法Ⅱ及方法Ⅲ，在485 nm處測(cè)定枸杞多糖的含量。結(jié)果表明：3種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.930 9、0.991 8、0.996 8；吸光值穩(wěn)定性RSD值分別為10.95%、2.13%、0.13%；采用方法Ⅲ，以3種已知含量樣品做回收率試驗(yàn)，3種樣品中方法Ⅲ的相對(duì)誤差分別為0.10%、0.04%和0.21%，無(wú)顯著差異。

試驗(yàn)證明，方法Ⅲ最優(yōu)。即先沸水浴15 min，利用硫酸將枸杞多糖分解為單糖，迅速脫水生成糠醛衍生物，再和苯酚縮合成有色化合物，反應(yīng)趨于完全后，立即進(jìn)行冰水浴，使反應(yīng)終止，放至室溫后測(cè)定其吸光值，可增加穩(wěn)定性，提高準(zhǔn)確度，增強(qiáng)可操作性。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.033

基金項(xiàng)目：武漢市漢陽(yáng)區(qū)科技創(chuàng)新項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：李良（1982—），男（漢），工程師，碩士研究生，主要從事飲料、酒類研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。

收稿日期：2015-05-11

Comparative Analysis Methods of Lycium barbarum Polysaccharide Content Determination

LI Liang，JIN Wen-juan

（Wuhan Pride Yellow Crane Tower Distillery Co.，Ltd.，Wuhan 430070，Hubei，China）

Abstract：Using the phenol-sulfuric acid method，with glucose as the standard by UV spectrophotometer and comparison of phenol-sulfuric acid method（methodⅠ），the method in China Pharmacopoeia（methodⅡ）and the method improved（methodⅢ），the content of Lycium barbarum polysaccharide was detected under 485 nm to compare the advantages of the three methods.Experiments showed that the three methods standard curve cor relation coefficient were 0.930 9，0.991 8，0.996 8，RSD of light absorption value stability were 10.95%，2.13%，0.13%；the relative error of recovery rate of methodⅢwas small，which showed no significant difference.It meant that the methodⅢwas the best.

Key words：Lycium barbarum polysaccharide；spectrophotometric method；comparative analysis