基于特征氨基酸指紋圖譜的白燕窩識(shí)別摻假模型建立與驗(yàn)證

莊俊鈺，許佩勤，林丹，鐘舒潔（1.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東廣州510308；2.廣東省食品工業(yè)研究所，廣東廣州510308；3.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510308）

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基于特征氨基酸指紋圖譜的白燕窩識(shí)別摻假模型建立與驗(yàn)證

莊俊鈺1，2，許佩勤1，2，林丹2，3，鐘舒潔1，2
（1.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東廣州510308；2.廣東省食品工業(yè)研究所，廣東廣州510308；3.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510308）

摘要：測(cè)定各類(lèi)燕窩和摻假樣品的氨基酸組成，通過(guò)主成分分析構(gòu)建白燕窩鑒別的綜合評(píng)價(jià)模型，運(yùn)用多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，初步建立燕窩摻假模型，并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，前兩個(gè)主成分提取了原來(lái)18個(gè)指標(biāo)87.75%的信息；利用綜合評(píng)價(jià)模型計(jì)算出各類(lèi)樣品的主成分得分，燕窩樣品在主成分得分圖中分布的位置較集中，摻假燕窩樣品則較分散；以摻假物質(zhì)含量作為自變量，綜合評(píng)價(jià)得分作為因變量，進(jìn)行線性回歸分析，單一物質(zhì)摻假的線性模型和混合摻假線性模型的線性系數(shù)R2＞0.98。模型驗(yàn)證誤差平均值為3.25%，說(shuō)明氨基酸指紋圖譜指紋譜圖鑒別法是一種有效且可靠性高的鑒別白燕窩的方法。

關(guān)鍵詞：白燕窩；摻假；主成分分析；多元線性回歸；建模

燕窩是由雨燕科動(dòng)物金絲燕及多種同屬燕類(lèi)用唾液與續(xù)羽等混合凝結(jié)所筑成的巢窩，其成分有水溶性蛋白質(zhì)、碳水化合物、微量元素以及對(duì)促進(jìn)人體活力起重要作用的氨基酸。燕窩按顏色可分為白燕窩、黃燕窩和血燕窩3種。由于其性?xún)r(jià)比，白燕窩比另外兩種燕窩更加受消費(fèi)者的青睞［1-3］。近年來(lái)，我國(guó)燕窩的消費(fèi)量仍在持續(xù)增長(zhǎng)。由于燕窩產(chǎn)品的珍貴及燕窩行業(yè)的高產(chǎn)值。為了牟取高額利潤(rùn)，不法商人利用價(jià)廉的材料全部偽制或部分替代真實(shí)燕窩產(chǎn)品，以達(dá)到增加重量、提高賣(mài)相、以假亂真等目的，市場(chǎng)中燕窩產(chǎn)品的質(zhì)量安全狀況令人擔(dān)憂［4］。

燕窩中氨基酸的含量、種類(lèi)及比例是評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一［4］。所以，對(duì)燕窩的氨基酸組成的監(jiān)測(cè)分析具有重要意義。近年來(lái)，多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)食品科學(xué)研究及其應(yīng)用產(chǎn)生了非常大的影響，比如食品感官分析、食品風(fēng)味及化合物分析、食用植物種類(lèi)的分類(lèi)與鑒別、食品腐壞的建模與預(yù)測(cè)等［5-6］。以此為出發(fā)點(diǎn)，本研究以白燕窩作為研究對(duì)象，采用氨基酸自動(dòng)分析儀技術(shù)測(cè)定白燕窩氨基酸組成，通過(guò)主成分分析構(gòu)建白燕窩鑒別的綜合評(píng)價(jià)模型，以摻假物質(zhì)含量作為自變量，綜合評(píng)價(jià)得分作為因變量，運(yùn)用多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，初步建立燕窩摻假模型，并進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)規(guī)范燕窩市場(chǎng)秩序、促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展和打擊假冒偽劣產(chǎn)品、維護(hù)消費(fèi)者健康安全具有重大意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

白燕窩：從各大品牌購(gòu)買(mǎi)的經(jīng)專(zhuān)家鑒定為真品的燕窩；干豬皮、豬浮皮、銀耳、雞蛋：購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；漿糊：購(gòu)于文具店。

鹽酸（GR）：廣州試劑廠；巰基乙酸（AR）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；茚三酮（AR）、檸檬酸鈉（AR）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

L-8900型高效氨基酸自動(dòng)分析儀：日本日立公司；DGG-9420A電熱恒溫干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司有限公司；分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HHS-2型電熱恒溫水浴鍋等；HGC-12A氮吹儀：江蘇漢邦科技有限公司；高純氮?dú)猓耗暇┨鞚蓺怏w有限責(zé)任公司。

1.3方法

1.3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取4個(gè)經(jīng)鑒定為真品的燕窩作為該研究的對(duì)照組，豬浮皮、銀耳、瓊脂、雞蛋清和漿糊作為摻假物質(zhì)，分別在真品燕窩中摻入2%、5%、10%、20%和50%的豬浮皮、銀耳和瓊脂；以雞蛋清和漿糊作為涂層摻假物質(zhì)，在燕窩上涂上均勻的涂層；兩種以上不同比例摻假物質(zhì)的設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.2樣品的處理

根據(jù)各樣品蛋白質(zhì)含量，取一定量的樣品于水解管中，加入6 mol/L鹽酸15 mL，以及3滴巰基乙酸，混勻。水解管充氮?dú)夂蠓饪冢糜?10℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22 h后，取出冷卻。用去離子水沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用去離子水定容。吸取2 mL濾液于小燒杯中，水浴蒸干。殘留物用1 mL超純水溶解，再蒸干，重復(fù)2次。冷卻后，加入10 mL 0.02 mol/L鹽酸溶解，溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)。

1.3.3色譜條件

離子交換柱規(guī)格4.6 mmID×60 mm，不銹鋼柱（日本公司生產(chǎn)的氨基酸分析專(zhuān)用樹(shù)脂）；泵流速P1：0.40 mL/min，P2：0.35 mL/min；柱溫：57℃，反應(yīng)溫度：135℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3.4數(shù)據(jù)分析

以18種氨基酸作為指標(biāo)，用SAS 9.1進(jìn)行主成分分析和多元線性回歸分析。Excel進(jìn)行線性回歸分析。

表1　混合摻假樣品Table 1　Samples of mixed adulteration

2　結(jié)果與分析

2.1燕窩摻假模型的氨基酸組成分析

4個(gè)真品燕窩、豬浮皮、銀耳、瓊脂、雞蛋清和漿糊的氨基酸組成結(jié)果見(jiàn)表2；單一物質(zhì)摻假燕窩的氨基酸組成結(jié)果見(jiàn)表3；兩種以上物質(zhì)不同比例摻假燕窩的氨基酸組成結(jié)果見(jiàn)表4。

由表2～表4可以看出，18種氨基酸組成為各類(lèi)樣品特征性指標(biāo)，不同類(lèi)型樣品的氨基酸組成均有差異。由于變量個(gè)數(shù)太多，并彼此之間存在一定的相關(guān)性，因而使得所觀測(cè)到的數(shù)據(jù)在一定程度上反映的信息有所重疊；而當(dāng)變量較多時(shí)，在高維空間中研究樣本的分布規(guī)律比較復(fù)雜，需要將多個(gè)指標(biāo)化為小數(shù)綜合指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2各類(lèi)樣品氨基酸組成的主成分分析

主成分分析是一種通過(guò)降維技術(shù)把多個(gè)變量化為少數(shù)幾個(gè)主成分（即綜合變量）的統(tǒng)計(jì)方法，利用模型“合成”為一個(gè)整體性的評(píng)價(jià)值，進(jìn)而對(duì)樣品總體進(jìn)行評(píng)價(jià)，不但可將多指標(biāo)問(wèn)題轉(zhuǎn)化為較少的綜合指標(biāo)，而且能給出較為客觀的權(quán)重，為燕窩真?zhèn)蔚蔫b別提供科學(xué)而客觀的評(píng)價(jià)方法。

表2　燕窩對(duì)照組和摻假物質(zhì)的氨基酸組成Table 2　Amino acid of control group and adulterant g/100 g

表3　單一物質(zhì)摻假燕窩的氨基酸組成Table 3　Amino acid of single adulteration　g/100 g

表4　 混合摻假樣品的氨基酸組成Table 4　Amino acid of mixed adulteration g/100 g

利用SAS9.1統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各類(lèi)樣品的氨基酸組成的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，表5為相關(guān)系數(shù)矩陣的特征值，相關(guān)系數(shù)矩陣的特征值越大，它所對(duì)應(yīng)的主成分變量包含的信息就越多。

表5　 特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 5　Eigenvalues and variance contributionrate

從表5可以看出，第1和第2主成分的特征值較大，說(shuō)明這兩個(gè)主成分包含了原來(lái)18個(gè)指標(biāo)大部分的信息。第4列為每個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率，第1和第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為60.35%和27.40%，其余主成分的貢獻(xiàn)率較小，最后1列為累計(jì)貢獻(xiàn)率。由此列數(shù)值可知，前兩個(gè)主成分提取了原來(lái)18個(gè)指標(biāo)87.75%的信息。綜合以上指標(biāo)，對(duì)前兩個(gè)主成分進(jìn)行深入分析。

表6為主成分分析得到的特征向量，根據(jù)特征向量構(gòu)建主成分與各類(lèi)樣品氨基酸組成之間的線性關(guān)系如下：

Y1=0.301 9x1+0.262 6x2+0.274 3x3+0.246 1x4+ 0.112 1x5+0.039 3x6+0.154 3x7-0.103 3x8+0.294 9x9+ 0.213 9x10+0.280 4x11+0.300 0x12+0.254 3x13+0.292 3x14+ 0.268 3x15+0.257 6x16+0.255 7x17-0.015 8x18

Y2=0.022 9x1-0.173 9x2-0.108 8x3+0.234 2x4+ 0.326 7x5+0.428 6x6+0.382 8x7+0.311 8x8-0.102 9x9+ 0.108 2x10-0.011 0x11-0.034 1x12-0.204 7x13-0.111 8x14+ 0.142 8x15-0.195 4x16+0.214 0x17+0.431 4x18

式中：Y1、Y2為綜合指標(biāo)，是樣品18個(gè)氨基酸組成的線性組合。

以?xún)蓚€(gè)主成分Y1、Y2與其方差貢獻(xiàn)率構(gòu)建各類(lèi)樣品氨基酸組成的綜合評(píng)價(jià)模型Z，Z為因變量，Y1、Y2為自變量，Z為Y1、Y2的線性組合：Z=0.6535Y1+ 0.274 0Y2。

表6　各指標(biāo)主成分特征向量Table 6　Eigenvectors of each index on PC

利用該模型計(jì)算出各類(lèi)樣品的主成分得分，真品燕窩和摻假樣品在第1、第2主成分的得分圖見(jiàn)圖1。

圖1　 主成分得分圖Fig.1　Diagram of PC scores

從圖1可以看出，燕窩樣品在主成分得分圖中分布的位置較集中，摻假燕窩樣品則較分散，可為初步判定燕窩真?zhèn)翁峁┮欢ǖ膮⒖純r(jià)值；部分摻假樣品與真品有不同程度的交叉重疊，需要建立不同水平的摻假模型進(jìn)行鑒別。

2.3單一物質(zhì)摻假燕窩的線性模型建立

以各單一物質(zhì)的摻假量為橫坐標(biāo)，樣品的綜合評(píng)價(jià)得分Z作為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，豬浮皮摻假會(huì)提高樣品的綜合評(píng)價(jià)，銀耳和瓊脂的摻假則會(huì)降低得分。對(duì)不同摻假水平下的樣品綜合得分進(jìn)行擬合，其回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2＞0.98，具有良好的相關(guān)性，擬合度高，說(shuō)明該模型可用于單一物質(zhì)的摻假鑒別。

2.4兩種以上物質(zhì)摻假燕窩的多元線性模型建立

利用綜合評(píng)價(jià)模型Z計(jì)算出混合摻假樣品的綜合評(píng)價(jià)得分，見(jiàn)表6。將綜合得分作為因變量，將變量x1、x2、x3作為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析?；貧w分析結(jié)果如表7、表8所示。

圖2　單一物質(zhì)摻假燕窩的線性模型Fig.2　Linear model of single adulteration

表7　 方差分析Table 7　Analysis of variance

表8　 參數(shù)估計(jì)Table 8　Parameter estimates

表7和表8結(jié)果表明，模型檢驗(yàn)（F=133.66，P＜0.000 1），表示模型通過(guò)檢驗(yàn)，達(dá)到顯著水平。在回歸系數(shù)檢驗(yàn)中，常數(shù)項(xiàng)（t=8.74，P=0.000 3）、x1（t=7.51，P= 0.0007）、x2（t=-15.84，P＜0.0001）、x3（t=-9.67，P=0.000 2），達(dá)到顯著水平，表明Y和常數(shù)項(xiàng)、x1、x2、x3存在顯著的線性關(guān)系。所以回歸方程為Y=0.474 3+2.433 3x1-5.135 9x2-3.135 9x3。決定系數(shù)（R2）為0.987 7，表明在變量Y的總變異中，由變量x1-x3線性說(shuō)明的部分占98.77%。

2.5模型驗(yàn)證

測(cè)定4個(gè)樣品的18種氨基酸組成。以各摻假物質(zhì)的含量為預(yù)測(cè)變量，綜合評(píng)價(jià)得分為因變量，代入摻假模型，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9　線性回歸模型檢驗(yàn)Table 9　Validation of linear regression model

4個(gè)樣品的模型預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值的誤差在-9.09%～22.22%之間，誤差平均值為3.25%，證明該方法建立的線性回歸模型對(duì)摻假物質(zhì)含量擬合良好。模型的誤差可能歸結(jié)于本研究中未納入考慮的將18種氨基酸指標(biāo)轉(zhuǎn)化為一個(gè)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)過(guò)程中所造成的誤差。

3　結(jié)論

1）利用SAS軟件對(duì)樣品的氨基酸組成進(jìn)行主成分分析，前兩個(gè)主成分提取了原來(lái)18個(gè)指標(biāo)87.75%的信息。根據(jù)特征向量構(gòu)建主成分與各類(lèi)樣品氨基酸組成之間的線性模型Y1、Y2。以?xún)蓚€(gè)主成分Y1、Y2與其方差貢獻(xiàn)率構(gòu)建各類(lèi)樣品氨基酸組成的綜合評(píng)價(jià)模型Z=0.653 5Y1+0.274 0Y2。

2）利用綜合評(píng)價(jià)模型模型計(jì)算出各類(lèi)樣品的主成分得分，燕窩樣品在主成分得分圖中分布的位置較集中，摻假燕窩樣品則較分散，可為初步判定燕窩真?zhèn)翁峁┮欢ǖ膮⒖純r(jià)值。

3）以摻假物質(zhì)含量作為自變量，綜合評(píng)價(jià)得分作為因變量，進(jìn)行線性回歸分析，單一摻假的線性模型和混合摻假線性模型的線性系數(shù)R2＞0.98。模型驗(yàn)證誤差在-9.09%～22.22%之間，誤差平均值為3.25%，證明該方法建立的線性回歸模型對(duì)摻假物質(zhì)含量擬合良好。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.031

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B040302015）

作者簡(jiǎn)介：莊俊鈺（1981—），女（漢），高級(jí)工程師，碩士，主要從事食品安全檢測(cè)與質(zhì)量研究工作。

收稿日期：2015-05-08

Construction and Validation of Adulteration Model of Edible Bird's Nest by Amino Acid

ZHUANG Jun-yu1，2，XU Pei-qin1，2，LIN Dan2，3，ZHONG Shu-jie1，2

（1.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station，Guangzhou 510308，Guangdong，China；2.Guangdong Provincial Public Laboratory of Food Industry，Guangzhou 510308，Guangdong，China；3.Guangdong Food Industry Institute，Guangzhou 510308，Guangdong，China）

Abstract：The amino acid composition of edible bird's nest（EBN）and adulterate EBN were analyzed by using an automatic amino.Principal component analysis（PCA）was applied to establish an evaluative model.Multivariate statistical methods were used to establish an adulteration model of EBN and verify.The results showed that prin 1 and prin 2 reflect 87.75%information of 18 indexes.Every sample was evaluated by PCA mathematical evaluative model and the PCA scores of EBNs were relative concentration than adulterate EBN.The parameters of adulteration content were analyzed as independent variables，and evaluative scores as the dependent variable for linear regression analysis.The final model were R2＞0.98.The determined values and the predicted values of the tested samples were fitted well with an average error of 3.25%.Therefore，the amino acids composition fingerprint could be used to distinguish adulterate bird's nest based on changes in content or proportion.

Key words：edible bird's nest；adulteration；multiple linear regression；principal components analysis （PCA）；modeling