響應面法優化香菇多糖脫色工藝研究

趙孝先，高玲，楊文，黃建麗，趙凱，，*（.河北醫科大學第四醫院，河北石家莊0500；.河北凱盛醫藥科技有限公司，河北石家莊05005；.江西歐氏藥業有限責任公司，江西新余8004）

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響應面法優化香菇多糖脫色工藝研究

趙孝先1，高玲1，楊文2，黃建麗3，趙凱2，3，*
（1.河北醫科大學第四醫院，河北石家莊050011；2.河北凱盛醫藥科技有限公司，河北石家莊050035；3.江西歐氏藥業有限責任公司，江西新余338004）

摘要：選擇不同大孔吸附樹脂對香菇多糖提取液脫色，發現DA201-CⅡ樹脂具有較好的脫色率，且對多糖的吸附也較少；在單因素試驗基礎上，通過Box-Benhnken中心組合試驗和響應面分析法，以香菇多糖提取液濃度、樹脂用量和溫度為自變量，脫色率為響應值，確定了利用DA201-CⅡ樹脂對香菇多糖提取液脫色的最佳工藝條件：香菇多糖提取液濃度為1.9mg/mL，樹脂用量為11g/100mL，溫度為51℃，脫色率達到最高為80.04%，多糖保留率最高為93.45%。

關鍵詞：香菇多糖；大孔吸附樹脂；響應面法；脫色

香菇多糖（Lentinan，LNT）是從傘菌科真菌香菇（Lentinus edodes）的子實體中分離到的一種β-1，3-葡聚糖，具有廣泛的藥理活性，如免疫調節作用、抗腫瘤、抗衰老作用、提高免疫和刺激干擾素形成、對化學物質所致肝損傷具有保護作用以及作為LAK細胞活性向上調節劑（LURA）等，已成為當前研究的熱點［1-5］。在香菇多糖的提取液中，色素、雜蛋白以及一些小分子物質是主要的雜質，色素的來源主要有3個方面：1）原料本身帶有的；2）菌體代謝所產生的；3）發酵液中某些成分的相互反應。目前多香菇多糖的脫色工藝主要有活性炭吸附法［6-9］、雙氧水氧化法［10-11］、樹脂吸附法［12-14］等，但脫色效果均不是很理想。本試驗探討了大孔吸附樹脂對香菇多糖提取液中色素的脫色研究，以便為采用樹脂吸附法脫色進行工業化設計及生產提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與設備

D3520、X-5、S-8、AB-8樹脂：購于南開大學化工廠；DA201-CⅡ樹脂：購于江蘇蘇青水處理工程集團有限公司。TU-1800S紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HHS-4S電子恒溫不銹鋼水浴鍋：余姚市上通溫控儀器廠；TGL-15B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；FA2004電子分析天平：上海精科天平公司。

香菇多糖提取液：自制［15-17］。

1.2方法

1.2.1多糖含量測定

采用校正的苯酚-硫酸法［18］，在490 nm波長下測定香菇多糖含量。多糖保留率按以下公式計算。

1.2.2色素測定

采用紫外分光光度計法測定420 nm波長處的吸光度［19］。脫色率按以下公式計算。

1.2.3樹脂預處理

大孔樹脂的預處理：工業級新樹脂使用前必須進行預處理，以去除樹脂中可能含有的未聚合的單體、致孔劑及分裂物等毒性物質［20］。

大孔吸附樹脂的靜態法預處理：

1）用95%乙醇在室溫條件下浸泡24 h，其間每隔15 min攪拌1次，每次浸泡2 h后濾出乙醇，加入新乙醇，最后用去離子水洗凈；

2）用4%鹽酸溶液室溫浸泡3 h，再用去離子水洗凈；

3）用5%Na0H溶液室溫浸泡3 h，再用去離子水洗凈；

4）用去離子水室溫浸泡24 h，使樹脂充分溶脹備用。

1.2.4樹脂篩選

準確稱取預處理過的各種大孔吸附樹脂20 g，分別置于250 mL磨口三口瓶中，加入多糖濃度為2× 10-3g/mL的溶液100 mL，恒溫振蕩，每1 h測定各樹脂的脫色率、多糖保留率。

1.2.5單因素條件確定

準確配置一定濃度的多糖溶液100 mL于錐形瓶中，按照一定比例加入大孔樹脂，調節至一定溫度后振蕩，每1 h測定各樹脂的脫色率、多糖保留率。

1.2.6響應面試驗

利用單因素試驗結果，利用Design-Expert試驗設計軟件對香菇多糖大孔樹脂脫色工藝進行優化，以香菇多糖初始濃度、脫色溫度、樹脂加入量設計三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗。Box-Behnken中心組合試驗因素與水平見表1。

表1　 響應面試驗因素水平Table 1　Factors，levels and cade of variables for response surface design

2　結果與討論

2.1樹脂篩選

在靜態吸附條件下，利用D3520、S-8、X-5、AB-8、DA201-CⅡ樹脂對香菇多糖提取液進行脫色研究，結果見圖1。

圖1　 脫色率及多糖保留率Fig.1　Decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖1中可以發現，在6種樹脂中，D3520、S-8、X-5 3種大孔吸附樹脂的脫色效果相差不是很大，大孔吸附樹脂AB-8、DA201-CⅡ的脫色效果藥明顯優于其余3種樹脂，大孔吸附樹脂X-5、DA201-CⅡ的多糖保留率要明顯優于其余3種樹脂，綜合考慮脫色率和多糖保留率，試驗選擇DA201-CⅡ大孔吸附樹脂進行脫色工藝優化。

2.2單因素試驗結果

2.2.1脫色溫度

以脫色率和多糖保留率為指標，考察了脫色溫度對脫色效果和多糖損失的影響。分別選取了20、30、40、50℃和60℃5個脫色溫度進行大孔樹脂脫色試驗，結果見圖2。

由圖2可以發現，脫色率隨著溫度升高而增加，當溫度達到50℃時，脫色率達到最大值80.05%，當溫度繼續增加時，脫色率出現了下降趨勢；而多糖保留率隨著溫度的增加而出現緩慢的下降。這是由于高溫會抑制大孔吸附樹脂的吸附能力，導致其對色素和多糖的吸附量的減少。綜合考慮脫色率和多糖保留率。選取50℃作為中心水平。

2.2.2樹脂加入量

以脫色率和多糖保留率為指標，考察了樹脂加入量對脫色效果和多糖損失的影響。分別選取了2.5、5.0、10、20、40 g/100 mL 5個樹脂加入量進行大孔樹脂脫色試驗，結果見圖3。

圖2　脫色溫度對脫色率和多糖保留率的影響Fig.2　The effects of extraction temperature on decolorization rate and polysaccharide retention rate

圖3　樹脂加入量對脫色率和多糖保留率的影響Fig.3　The effects of addition resin on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖3可以發現，隨著樹脂加入量的增加，脫色率也隨之增大，而多糖保留率會隨著樹脂加入量的增加而呈現下降趨勢。這是由于足夠量的樹脂，雖然可以充分吸附色素，但是對多糖的吸附也會增大。綜合考慮脫色率和多糖保留率。選取10 g/mL作為中心水平。

2.2.3香菇多糖提取液濃度

以脫色率和多糖保留率為指標，考察了香菇多糖提取液濃度對脫色效果和多糖損失的影響。分別選取了0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL和8.0 mg/mL 5個香菇多糖提取液濃度進行大孔樹脂脫色試驗，結果見圖4。

圖4　香菇多糖提取液濃度對脫色率和多糖保留率的影響Fig.4　The effects of lention concentration on decolorization rate and polysaccharide retention rate

由圖4可以發現，隨著香菇多糖提取液濃度的增加，脫色率也逐漸增大，當香菇多糖初始濃度達到2 mg/mL時，脫色率達到最大（79.16%），繼續增加濃度時，脫色率無明顯變化。多糖保留率則隨著香菇多糖提取液濃度的增加呈現出緩慢的下降，基本保持在93%左右。綜合考慮脫色率和多糖保留率。選取2 mg/mL香菇多糖提取液濃度作為中心水平。

2.3響應面試驗結果及數據分析

從單因素試驗結果可以發現，3個因素對脫色率的影響非常明顯，對多糖保留率的影響不顯著。因此，以脫色率為響應值Y，試驗結果見表2。

表2　響應面分析試驗結果Table 2　Test design and results of response surface analysis

對所得試驗數據進行回歸分析，得到回歸方程：

Y=79.99+0.31A+0.59B-0.44C-0.20AB+0.035AC-0.72BC-2.94A2-2.89B2-3.94C2

對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表3　回歸模型方差分析Table 3　Variance analysis of regression model

續表3　 回歸模型方差分析Continue table 3　Variance analysis of regression model

回歸模型P＜0.0001，表明回歸模型極顯著；失擬項P=0.258 0，不顯著，說明該模型成立。回歸模型中一次項B、C、二次項BC、A2、B2、C2對Y值的影響顯著。模型相關系數R2=0.992 0，說明擬合程度好，校正決定系數R2adj=0.981 7。由F值可知，各因素對多糖脫色率的影響大小順序為B（樹脂加入量）＞C（濃度）＞A（脫色溫度）。

2.4響應面分析及最優脫色條件確定

根據回歸方程做出相應面分析圖及等高線，見圖5～圖7，Y為脫色率。

圖5　響應面法（脫色溫度、樹脂用量）立體分析圖和等高線圖Fig.5　The graph of response surface methodology（decoloration temperature，addition resin）including 3D and corresponding contour map

圖6　響應面法（脫色溫度、香菇多糖提取液濃度）立體分析圖和等高線圖Fig.6　The graph of response surface methodology（decoloration temperature，lention concentration）including 3D and corresponding contour map

圖7　響應面法（樹脂用量、香菇多糖提取液濃度）立體分析圖和等高線圖Fig.7　Thegraphofresponsesurfacemethodology（additionresin，lentionconcentration）including3Dandcorrespondingcontourmap

回歸模型中Y的最大估值為80.64%，與之對應的自變量脫色溫度（A）、樹脂加入量（B）和香菇多糖提取液濃度（C）分別為50.59℃、10.55 g/100 mL、1.94 mg/mL。根據實際操作，選取脫色溫度（A）=51℃，樹脂加入量（B）=11 g/100 mL，香菇多糖提取液濃度（C）=1.9 mg/mL。

2.5驗證試驗

在優化后的脫色條件下進行3次平行驗證試驗，結果表明DA201-CⅡ樹脂對香菇多糖脫色率為80.04%，多糖保留率為93.45%，與預測者接近，及擬合度良好。

3　結論

采用了響應面分析法對香菇多糖提取液進行了大孔樹脂脫色研究。通過樹脂篩選得到了適合香菇多糖脫色的大孔樹脂DA201-CⅡ；利用單因素試驗與Box-Benhnken中心組合試驗。對脫色工藝進行了因素考察優化。通過二次回歸獲得了各個因素的回歸模型，并得到了最優脫色條件：脫色溫度（A）=51℃，樹脂加入量（B）=11 g/100 mL，香菇多糖提取液濃度（C）= 1.9mg/mL。其脫色率為80.04%，多糖保留率為93.45%，該結果為樹脂吸附法脫色進行工業化設計及生產提供基礎數據。

參考文獻：

［1］Xiaoqin Huang，Zongcai Tu，Ying Jiang，et al.Dynamic high pressure microfluidization-assisted extraction and antioxidant activities of lentinan［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012 （51）：926-932

［2］Jie Wang，Hongyan Wang，Xiaoming Xia，et al.Inhibitory effect of sulfated lentinan and lentinan against tobacco mosaic virus（TMV）in tobacco seedlings［J］.Biological Macromolecules，2013（61）：264-269

［3］Leandro G Nandi，Joao P T A Guerra，Ismael C Bellettini，et al. Properties of aqueous solutions of lentinan in the absence andpresence of zwitterionic surfactants［J］.Carbohydrate Polymers，2013 （98）：1-7

［4］ YangYang Zhang，Sheng Li，Xiaohua Wang，et al.Advances in？lentinan：Isolation，structure，chain conformation and bioactivities ［J］.Food Hydrocolloids，2011（25）：196-206

［5］Yinghua Liu，Shoudong Ma，Qingjie Fu，et al.Effect of lentinan on membrane-bound protein expression in splenic lymphocytes under chronic low-dose radiation［J］.International Immunopharmacology，2014（22）：505-514

［6］楊勇，錢運華，賈建波.活性炭/凹土吸附劑香菇多糖提取液脫色研究［J］.安徽農業科學，2011，39（35）：21959-21961，21964

［7］賈淑珍，王成忠，于功明.香菇多糖脫色方法的研究［J］.食品科技，2007（6）：113-115

［8］向東，王國政，賴鳳英，等.活性炭對南瓜粗多糖液的脫色研究［J］.河南科學，2004，22（6）：780-782

［9］包東伍，趙永亮，王衛國，等.灰樹花多糖脫色技術研究［J］.中國食用菌，2003，22（6）：49-51

［10］Jianhua Xie，Mingyue Shen，Shaoping Nie，et al.Decobrization of polysaccharides solution from Cyclocatya paliurus（Batal）Lijinskajia using ultrasound/H2O2process［J］.Carbohydrate Polymers，2011 （84）：255-261

［11］陳建，耿安靜，徐曉飛.香菇多糖的過氧化氫脫色工藝研究［J］.食品工業科技，2010，31（3）：293-295

［12］于海寧，朱驚，劉研，等.大孔樹脂法用于江蘺多糖脫色的工藝研究與優化［J］.浙江工業大學學報，2014，42（4）：418-421

［13］謝紅旗，周青山.香菇多糖脫色工藝研究［J］.離子交換與吸附，2007，23（2）：158-165

［14］袁紅波，張勁松，賈薇，等.利用大孔樹脂對低分子量靈芝多糖脫色的研究［J］.食品工業科技，2009，30（3）：204-206

［15］Mei Zhang，Lina Zhang，Peter Chi Keung Cheung，et al.Molecular weight and Anti-tumor activity of the water-soluble polysaccharides isolated by water and ultrasonic treatment from the scerotia and mycelia of Pleurotus Tuber-regium［J］.Carbohy'drate Polymers，2004，56（2）：123-128

［16］林宇野，楊虹.酶法提取銀耳多糖的研究［J］.食品與發酵工業，1995（1）：13-17

［17］陳哲超，林宇野，謝必峰，等.復合酶解法提取香菇多糖蛋白的研究［J］.生物工程進展，1995，15（1）：47-50

［18］Dubois M，Gilles K A，Hamitton J K，et al.Colorimetric method for etermination of sugars and related substances［J］.nalytical Chemistry，1956，8（3）：50-56

［19］肖靜怡，黃可龍，洪涌，等.陽離子樹脂對香菇多糖中色素的吸附性能研究［J］.中國生化藥物雜志，2008，28（6）：386-390

［20］王廣珠，汪德良，崔煥芳.離子交換樹脂使用及診斷技術［D］.北京：化學工業出版社，2005

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.024

作者簡介：趙孝先（1968—），男（漢），主治醫師，學士，從事藥物研發與臨床應用。

*通信作者：趙凱（1965—），男（漢），正高級工程師，博士，主要從事藥物研究與開發工作。

收稿日期：2015-05-19

Optimizaition of Decolorization of Lentinan Using Response Surface Methodology

ZHAO Xiao-xian1，GAO Ling1，YANG Wen2，HUANG Jian-li3，ZHAO Kai2，3，*

（1.The Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，Hebei，China；2.Hebei Kingsci Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Shijiazhuang 050035，Hebei，China；3.Jiangxi Ourshi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Xinyu 338004，Jiangxi，China）

Abstract：The application of macroporous adsorption resin to purify lentinan，it was found that macroporous adsorption resin DA201-CⅡhad the highest decolorization rate and the lowest polysaccharide retention rate.With decolorization rate as the response value，the influence of amount of lention concentration，addition resin，and decoloration temperature on the process of decolorization were investigated systematically by using one-factor experitments and Box-Behnken design.The results showed that the optimum decolorizing conditions of lentinan by resin DA201-CⅡwere as follows：lention concentration 1.9 mg/mL，addition resin 11 g/100 mL，decoloration temperature 51℃.Under this condition，the decolorization rate and retention rate of polysaccharide were 80.04%and 93.45%.

Key words：lentinan；macroporous adsorption resin；response surface methodology；decolorization