茯苓-香菇柄-山楂葉固態發酵物的抗氧化作用

王謙，安雪，劉敏（河北大學生命科學學院，河北保定071002）

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茯苓-香菇柄-山楂葉固態發酵物的抗氧化作用

王謙，安雪，劉敏
（河北大學生命科學學院，河北保定071002）

摘要：以香菇柄、山楂葉為主料，按照一定比例制備固態發酵培養基，將茯苓轉接到固態發酵基質中培養，將滿管8 d后的固態發酵物烘干；通過超聲波提取方法對茯苓-香菇柄-山楂葉固態發酵物和原料基質中總黃酮進行提取，經對比可知，固態發酵物中總黃酮含量要高于原料基質中的含量；固態發酵物中含有多糖、總黃酮等功能因子，具有抗氧化、延緩衰老的作用，通過加壓提取的方式獲得固態發酵提取液和原料基質提取液后，取適量提取液添加到玉米油、卵黃中，發現固態發酵提取液的抗脂質過氧化作用要顯著優于原料基質組；因此將固態發酵提取液開發成功能食品，具有很廣闊的發展前景。

關鍵詞：茯苓；香菇柄-山楂葉；總黃酮；脂質過氧化

香菇柄和山楂葉均屬于農林廢棄物，但其含有多種功能物質。香菇柄與菌蓋一樣富含多糖、蛋白質、嘌呤等成分，具有提高免疫力［1］、抗病毒、抗血脂的作用，目前已有將香菇柄開發成食品［2-3］，如香菇脯、香辣香菇醬［4］；山楂葉具有活血散結、抗氧化、溫補開胃等作用［5］。我國廣西、江西等地的藥材規則中都存在山楂葉藥用的記載，并且山楂葉于2005年正式收錄于《中國藥典》［6］。山楂葉含有多種生物活性物質，如總黃酮類物質［7］可調節血脂、多酚類成分，是抗氧化作用的重要活性物質［8］。將茯苓菌在以香菇柄-山楂葉為主料固態發酵的方式，不僅使固態發酵物中富含多種功能因子，更重要的是符合經濟的可持續發展戰略。在前面報道的文章中可知，固態發酵物中多糖、氨基酸含量顯著高于原料基質組［9］，本研究中將對兩種復合物中總黃酮含量進行對比，通過功能學試驗對固態發酵提取液和原料基質提取液進行研究，證明通過固態發酵的方式制備的固態發酵物，是否具有優越性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

香菇柄、山楂葉：由河北大學食藥用真菌研究生提供；蘆丁（純度UV≥98%）：天津市光復科技發展有限公司；玉米油、雞蛋：市售。

蛋白/核酸分析儀（CECIL9560）：英國Cecil；超聲波細胞粉碎機：寧波海曙科生超聲設備有限公司；722型分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1蘆丁標準曲線的繪制

將蘆丁標品烘干至恒重后，精密稱取10 mg蘆丁標品于裝有25 mL 50%無水乙醇的燒杯中，超聲處理45 min使其溶解，將蘆丁溶液置于50 mL容量瓶中，加50%無水乙醇至刻度，搖勻備用。通過蛋白/核酸分析儀對蘆丁溶液進行全波長掃描，確定蘆丁的最大吸收波長。

精密量取蘆丁標準品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別裝于10 mL容量瓶中，加50%無水乙醇至刻度，震蕩搖勻，以50%無水乙醇為空白對照，在最大吸收波長處測定吸光度值，繪制標準曲線［10］。

1.3.2兩種培養物中總黃酮含量的測定

（2）鄉鎮畜牧獸醫工作人員的專業性不強。2008年獸醫體制改革后，鄉鎮級獸醫站實現人、財、物三權規鄉鎮。鄉鎮級獸醫站工作人員承擔了過多的業務工作以外的工作。另外，鄉鎮獸醫站經費短缺。

將兩種培養物烘干后，各稱取0.2 g溶于20 mL 50%無水乙醇中，超聲處理45 min后，6 000 r/min離心6 min，合并上清液，加50%無水乙醇至20 mL。精密量取1 mL于10 mL容量瓶中，加50%無水乙醇至刻度。以50%無水乙醇為空白對照，在最大吸收波長處測兩種培養物的吸光度值，計算總黃酮含量。

1.3.3碘標準曲線的制作

取一系列10 mL比色管，加入40∶60（體積比）異辛烷-冰乙酸［11］5 mL，再分別加入碘標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，搖勻后，各加入1.0 mL的淀粉指示劑，加水至刻度后，搖勻，靜置5 min，以蒸餾水為空白對照，于535 nm處測吸光度值。

1.3.4固態發酵提取液和原料基質提取液抗玉米油過氧化作用

精確量取0.5 mL玉米油于干燥的10.0 mL試管中后，加入40∶60（體積比）的異辛烷-冰乙酸5 mL，之后再加入飽和KI溶液0.5 mL，輕輕搖勻后，加入固態發酵提取液和原料基質提取液各1mL，對照組加入1.0 mL蒸餾水，搖勻后反應3 min，取出后加入10 g/L淀粉溶液1.0 mL，之后加水稀釋至刻度，搖勻后靜置5 min，取分層后的上清液，于535 nm處測吸光度值［12-13］，統稱為OD1。由于固態發酵提取液和原料基質提取液有一定的顏色，為了避免顏色的干擾，取兩種提取液各1 mL 于10mL比色管中，加蒸餾水至刻度后，搖勻，于535nm處測吸光度值，統稱為OD2，則最終OD值為OD1減去OD2。

1.3.5卵黃懸液的制備

將新鮮雞蛋的蛋殼輕輕敲碎，分離蛋黃，用濾紙輕輕吸取殘余蛋清，將卵膜劃破收集卵黃，用0.1 mol/L pH 7.4的PBS按1∶1（體積比）配成懸液后并稀釋成1∶25（體積比），混勻備用［14］。

1.3.6卵黃固態發酵提取液和原料基質提取液的抗卵黃脂質過氧化作用

向比色管中加入上述卵黃懸液0.3 mL，然后分別加入固態發酵提取液和原料基質提取液1 mL，對照組加入1 mLPBS，再加入25 mmol/L的硫酸亞鐵0.2 mL，用0.1 mol/L pH 7.4 PBS補至5 mL，置于37℃水浴震蕩50 min，取出后加入20%的三氯醋酸0.5 mL，靜置10 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入0.8%硫代巴比妥酸1.0 mL，532 nm［15-16］處測光度值，統稱為OD1；重復以上操作，加入硫代巴比妥酸后，擰緊管口，100℃下水浴15 min，對照組以PBS代替上清液，532 nm處測光度值，統稱為OD2；最終OD值為OD1減去OD2。

2　結果與分析

2.1蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁最大吸收波長如圖1所示。

圖1　蘆丁最大吸收波長Fig.1　The maximum absorption wavelength of rutin

根據掃描結果可知，在257 nm和364 nm處有最大吸收峰，選取364 nm為蘆丁的最大吸收波長。

以50%無水乙醇為對照，在364 nm處測定不同濃度的蘆丁溶液的吸光度值，并繪制蘆丁標準曲線，如圖2所示。

2.2未經茯苓菌發酵的原料基質和固態發酵物中總黃酮含量比較

未經茯苓菌發酵的原料基質和固態發酵物中總黃酮含量比較如表1所示。

由表1可知，相同質量的兩種培養物中，固態發酵物中總黃酮含量明顯高于未經茯苓菌發酵的原料基質中總黃酮含量。

圖2　 蘆丁標準曲線Fig.2　Standard curve of rutin

表1　兩種復合物中的總黃酮含量Table 1　Total flavonoids concentration of extract two complex

2.3碘標準曲線的繪制

碘標準曲線如圖3所示。

圖3　碘標準曲線Fig.3　Standard curve of iodine

2.4添加兩種提取液后玉米油過氧化值的測定

通過碘標準曲線，分別計算出加入蒸餾水、原料基質提取液、固態發酵提取液后產生的碘的質量；通過下列公式計算出玉米油的過氧化值。

式中：X1為樣品的過氧化值，g/100 g；X2為樣品過氧化值，meq/kg；m為樣品的吸光度值對應的碘質量，mg；m1為樣品質量，g。

玉米油中的過氧化值如表2所示。

表2　玉米油中的過氧化值Table 2　The peroxide value of corn oil

由表2可知，與空白對照組相比，向玉米油中加入固態發酵提取液和原料基質提取液后，對玉米油的過氧化作用均有抑制效果，其中加入固態發酵提取液后，玉米油的過氧化值最低，說明固態發酵提取液的抗油脂過氧化能力高于原料基質提取液的能力。

2.5固態發酵提取液抗卵黃的脂質過氧化研究作用

抑制率/%=（OD對照－OD樣品）/OD對照×100，式中：OD對照為對照組的吸光度值；OD樣品為樣品的吸光度值本試驗中，添加固態發酵提取液和未發酵提取液后的抑制情況如表3所示。

表3　固態發酵提取液對卵黃脂質過氧化的抑制作用Table 3　Solid-state fermentation extract of yolk inhibition of lipid peroxidation

由表3可知，在卵黃體系中，加入一定濃度的固態發酵提取液和原料基質提取液后，對卵黃的脂質過氧化均有抑制作用，說明這兩種提取液均具有抗氧化的能力；試驗結果中固態發酵提取液的抑制率更高，說明通過茯苓菌的固態發酵后，使固態發酵物中合成了新的功能因子或者增多了原有的功能因子，也進一步說明了固態發酵過程是有很大必要的。

3　結論

在玉米油脂質過氧化試驗、卵黃脂質過氧化試驗中，加入固態發酵提取液和原料基質提取液后，均抑制了玉米油和卵黃的脂質過氧化反應，說明了原料基質具有抗氧化的功能物質，如多糖、總黃酮類等，在前面的試驗中也確實證實了這一點；兩個功能學試驗中，添加固態發酵提取液后，對油脂和卵黃的過氧化的抑制情況均優于添加原料基質提取液組，說明經過茯苓菌固態發酵得到的固態發酵物中確實產生了新的功能因子，或者增多了原來的功能物質，才使得其抗氧化作用增強。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.007

基金項目：河北省現代農業產業技術體系食用菌創新團隊（冀農科發［2013］23號）

作者簡介：王謙（1962—），男（漢），研究員，本科，從事食藥用真菌研究與開發工作。

*通信作者

收稿日期：2015-05-20

Antioxidation of Solid Yeast of Poria Cocos-Roots of Lentinus Edodes-Hawthorn Leaf

WANG Qian，AN Xue，LIU Min

（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China）

Abstract：According to certain proportion to prepare solid state fermentation medium of root of lentinus edodes and hawthorn leaf as main ingredient，cultivated solid-state fermentation substrates switching tuckahoe，and dryed solid yeast of the full 8 days.By ultrasonic extraction method of poria cocos-roots of lentinus edodeshawthorn leaf solid fermentationcompoungs and medium to extract total flavonoids in raw materials，the total content of flavonoids in the solid state yeast was higner than raw material content of the matrix in contrast.Functional factors such as polysaccharides，flavonoids contained in solid yeast had antioxidant，anti-aging effect. Added adequate amount of solid-state fermentation extract and raw material after matrix obtained by means of pressurized extraction to the corn oil and egg yolk，founded that solid-state fermentation extract of lipid peroxide oxidation resistance was significantly better than the raw material base.So that developed solid-state fermentation to be funtied food will have the very broad development prospects.

Key words：poria cocos；root of lentinus edodes and hawthorn leaf；total flavonoids；lipid peroxidation