鹽酸小檗堿對MCF-7乳腺癌小鼠體內抑制腫瘤生長的實驗研究

曾智豪，　陳小伍　朱達堅，　羅仲燃，　楊　敏

(南方醫科大學附屬順德第一人民醫院，　廣東　順德　528300)

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鹽酸小檗堿對MCF-7乳腺癌小鼠體內抑制腫瘤生長的實驗研究

曾智豪，陳小伍朱達堅，羅仲燃，楊敏

(南方醫科大學附屬順德第一人民醫院，廣東順德528300)

【摘要】目的：研究鹽酸小檗堿對MCF-7乳腺癌小鼠體內產生的作用與影響，為其臨床應用建立理論基礎。方法：建立人乳腺癌細胞系MCF-7裸鼠腫瘤模型，采用隨機分組方法分為對照組，治療組與陽性對照組，其中A為對照組，B為小檗堿治療組(再以10、20、25mg/kg的不同劑量分為B1，B2，B3組)，C為多西他賽陽性對照組。每組共8只小鼠，采用皮下異種移植腫瘤小鼠模型對鹽酸小檗堿的抗腫瘤療效進行評價，評價內容包括鼠瘤體積變化以及腫瘤抑制率。結果：給藥結束后，從鼠瘤體積變化來看，三組治療組的情況均優于對照組，其中應用25mg/kg的B3組的情況最好，鼠瘤體積僅為(451.57±6.20)mm3。而在腫瘤抑制率方面，小檗堿三種劑量治療組和陽性對照組的TGI值分別是5.55%、4.91%、58.88%、67.72%；相對腫瘤增殖率(T/C)%值分別為96.25%、92.29%、51.23%、44.08%，差異具有統計學意義。結論：小檗堿在人乳腺癌細胞系MCF-7裸鼠腫瘤模型中具有較好的抑制腫瘤生長的作用，且呈良好的劑量依賴性。

【關鍵詞】小檗堿；乳腺癌；MCF-7

小檗堿，又名黃連素，是一種常見的異喹啉類生物堿，臨床上主要用于腸道感染的治療。目前一些研究認為，小檗堿對多種腫瘤均有不同程度的抑制作用，并有體外實驗證明[1]，小檗堿能明顯抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖，其抑制率與藥物濃度和作用時間呈依賴關系。本研究通過體內試驗來觀察小檗堿抗乳腺癌的作用。

1材料與方法

1.1試劑及設備:試劑：鹽酸小檗堿(Sigma，0713-9977)；MEM細胞培養液(Gibco,批號：1621365)；胎牛血清(INVITROGEN；批號：1565565)；青霉素鏈霉素(Hyclone；批號：J122331)；人乳腺癌細胞系MCF-7(ATCC)；多西他賽(LC Laboratories，批號：114977-28-5)羧甲基纖維素(Sigma，批號：BCBN1024N),吐溫80(Sigma，批號：MKBG9019V)。主要設備：電子天平(上海光正，YP1102)；德國Sigma高速冷凍離心機(Sigma 3-30K)。光學顯微鏡(OLYMPUS，DP71)。

1.2動物:BALB/C裸鼠由上海大學生命科學院提供。合格證：SCXK(滬)2014-0005，均為雌性，飼養于SPF級別環境中，重量18～22g，6周齡，動物房溫度23～25℃，濕度保持40～60%。

1.3細胞培養、腫瘤接種:實驗鼠給予雌激素片(0.5mg,60day srelease)接種于皮下。MCF-7細胞體外懸浮培養，培養條件為MEM培養基中加10%熱滅活胎牛血清，100U/mL青霉素及100U/mL鏈霉素37℃ 5% CO2培養。一周兩次傳代處理。當細胞呈指數生長期時，收取細胞，計數，接種。將含1×107個MCF-7細胞的0.2mL細胞懸液(細胞懸于MEM基礎培養基:基質膠=100μL:100μL)皮下接種于每只小鼠的右后背。腫瘤平均體積達到145.32(100～200)mm3時開始分組給藥。

1.4動物分組與給藥方案:小鼠隨機進行分組，分為溶劑對照組(A)、治療組(B)，B組以10、20、25mg/kg的不同劑量分為B1，B2，B3組，C組為陽性對照組，應用多西他賽。具體給藥方式見下表：

表1　動物實驗分組和給藥方案

注：空白對照組(A)配置方法為0.5% CMC-Na+0.2%吐溫80

1.5實驗動物日常觀察:每天監測動物的健康狀況及死亡情況，例行檢查包括觀察藥物對動物日常行為表現的影響，如行為活動，攝食攝水量，體重變化(每周測量兩次體重或每隔1d測量)，外觀體征或其它不正常情況。基于各組動物數量記錄組內動物死亡數和副作用。

1.6實驗指標:考察腫瘤生長是否可以被抑制、延緩或治愈。每周兩次用游標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V=0.5a×b2，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。鹽酸小檗堿的抑瘤療效用TGI(%)來評價。TGI(%)，反映腫瘤生長抑制率。TGI(%)的計算：TGI(%)=[1-(處理組給藥結束時瘤體積-處理組給藥開始時瘤體積)/(溶劑對照組給藥結束時瘤體積-溶劑對照組給藥開始時瘤體積)]×100%。TGI≥58%認為此藥有效；TGI≥90%，認為此藥極有效。

1.7統計分析:用SPSS17.0，進行所有數據分析，包括t檢驗，重復測量方差分析。

2結果

2.1各組小鼠21d中的體重變化:各組大鼠用藥后的體重變化如下表所示，每組大鼠在第21天時的體重均比第1天有所下降，其中C組的大鼠的體重在第21天時較其余組下降的更多，對各組進行了重復測量方差分析，具有統計學差異，見表2。

表2　實驗期間各組大鼠體重記錄(g)

P*<0.001

2.2各組MCF-7乳腺癌鼠瘤體積變化:給藥過程中，給藥組動物的一般情況和進食量與陰性對照組差別無統計學意義，試驗結果見表2。可見不同劑量的鹽酸小檗堿對乳腺癌瘤體具有不同的抑制作用。

表2　實驗期間各組鼠瘤體積的變化比較(mm3)

從鼠瘤體積變化來看，A組對照組的小鼠在21d時已經達到(881.48±17.12)mm3，B3組的小鼠在第21天瘤體積為(451.57±6.20)mm3，C組陽性對照組21d小鼠的瘤體積為(388.62±4.54)mm3。在第21天，B3組與B兩組相比較差異有統計學，而B3組與C組比差異有統計學意義。

圖1　試驗期間各組鼠體重變化示意圖

注：C組(陽性對照組)于第10天，第15天，第16天分別有一只小鼠死亡。

圖2　實驗期間各組鼠瘤體積的變化比較圖示

2.3腫瘤抑制率：給藥結束后(第22天)，小檗堿B1、B2、B3治療組和陽性對照組的TGI值分別是5.55%、4.91%、58.88%、67.72%；相對腫瘤增殖率(T/C)%值分別為96.25%、92.29%、51.23%、44.08%。

圖3　A組與B3組的腫瘤組織照片

在第23天，對實驗小鼠進行安樂死，取瘤稱重并拍照，從照片中可以看到B3組小鼠的腫瘤組織要明顯小于對照A組小鼠的腫瘤組織。

3討論

小檗堿是中藥黃連的主要有效成分，早在20世紀70年代就已有日本學者提出小檗堿及其類似物具有抗腫瘤活性[2]。由于該藥價格低廉、來源廣泛、不良反應少等特點近年來其抗腫瘤作用而備受關注。文獻報道，鹽酸小檗堿在體外可顯著抑制多種腫瘤細胞如前列腺癌[3]、白血病[4]、胃癌[5]、乳腺癌。而對于乳腺癌關于其體內研究尚未見報道，本研究希望通過體內試驗來觀察小檗堿抗乳腺癌的作用并分析其機制。

在本實驗中，分別應用了小檗堿10、20、25mg/kg的三種劑量作為治療組與對照組進行皮下異種移植腫瘤模型的抗腫瘤藥效比較，而常用的乳腺癌治療藥物多西他賽作為陽性對照組。本次實驗的給藥周期為21d，采用腹腔注射的方法。給藥期間陽性對照組有一只受試小鼠在第8天時體重下降達到27.33%，依照動物福利指導原則，對其實施了安樂死。在給藥結束后(第21天)，從鼠瘤體積變化來看，A組對照組的小鼠在21d已經達到(881.48±17.12)mm3，B1、B2的兩組數據雖然較A組略好，但并無統計學差異。而應用25mg/kg的B3組第21天的數據顯示其治療情況優于對照組，鼠瘤體積為(451.57±6.20)mm3，與A組相比差異有統計學意義(P<0.001)，C組多西他賽作為陽性對照組的小鼠瘤體積在第21天優于其他各組，差異具有統計學意義。而在腫瘤抑制率方面，小檗堿三種劑量治療組和陽性對照組的TGI值分別是5.55%、4.91%、58.88%、67.72%；相對腫瘤增殖率(T/C)%值分別為96.25%、92.29%、51.23%、44.08%，B3組表現出差異具有統計學意義。而從副反應來考慮，各組小鼠在治療第21天時，C組多西他賽陽性對照組小鼠的體重降低，而另四組相似，差異具有統計學意義。從結果上看，給藥結束時，小檗堿25mg/kg劑量的B3治療組對MCF-7乳腺癌小鼠皮下移植瘤具有一定的抑制腫瘤生長的作用，且呈良好的劑量依賴性，這與一些體外實驗的結果相似，雖然其療效不如多西他賽，但其副作用顯著優于多西他賽所在的陽性對照組。

【參考文獻】

[1]趙小飛，毛婷婷.小檗堿抗乳腺癌機制研究進展[J].中國中醫基礎醫學雜志,2015,21(1):114～116.

[2]山田陽城.黃連素的藥理和藥效[J].國外醫學·植物藥分冊,1993,8(2):70～73.

[3]Mantena SK, Sharma SD, Kaiyar SK. Berberine, a natural product, induces G1-phase cell cycle arrest and caspase-3-dependent apoptosis in human prostate carcinoma cells[J].Molecular Cancer Therapeutics,2006,5:296～308.

[4]Lin CC, Lin SY, Chung JG, et al. Down-regulation of cyclin B1 and up-regulation of Wee1 by berberine promotes entry of leukemia cells into the G2/M-phase of the cell cycle[J].Anticancer Research,2006,26:1097～1104.

[5]Letasiova, Jantova S, Cipak L, et al. Berberine-antiproliferative activity in vitro and induction of apoptosis/necrosis of the U937and B16 cells[J].Cancer Lett,2005,239(2):254～262.

【基金項目】廣東省醫學科研基金資助，(編號：B2012050)

【通訊作者】陳小伍,Email：zhihaotsang@163.com

【文章編號】1006-6233(2016)06-0988-04

【文獻標識碼】A【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.06.041