SD大鼠睪丸中PELP1表達的激素相關性研究

祝　強，　董　雋，　王春揚，　單立松，　孫　幀，　朱大慶，　洪寶發

(中國人民解放軍總醫院泌尿外科,　北京　海淀區　100853)

?

基礎研究

SD大鼠睪丸中PELP1表達的激素相關性研究

祝強，董雋，王春揚，單立松，孫幀，朱大慶，洪寶發

(中國人民解放軍總醫院泌尿外科,北京海淀區100853)

【摘要】目的：探討PELP1在睪丸組織中的表達。方法：將21只8周齡SD大鼠隨機分為對照組、去勢組、去勢并補充雌激素組。通過RT-PCR與免疫組織化學的方法進行檢測，當雌激素水平不同時，PELP1在睪丸組織中的表達如下。結果：PELP1在大鼠睪丸組織中表達，并且隨著雌激素水平的增高而增高。結論：PELP1在大鼠睪丸組織中的表達與雌激素水平正相關。

【關鍵詞】雌激素;PELP1;SD去勢大鼠;睪丸

雌激素具有生物調節作用，主要通過調節因子和雌激素受體作用于靶器官，如骨、腦、心及乳腺等。雌激素受體表達于睪丸間質細胞，與雌激素結合，調節睪丸間質細胞雄激素的合成與釋放，影響生殖細胞的發生、發育。雄性動物體內的雌激素1/3來源于睪丸。雖然雄性動物血液中的內源性雌激素濃度較低，但是其在精液中的濃度卻極高，睪丸網液中濃度達到250ng/L，與雌性動物血清中雌二醇相比，濃度明顯偏高。PELP1具有重要調節作用，主要用于調節雌激素受體和雌激素，參與雌激素的非基因和基因兩種信號的介導。在子宮、乳腺及腦等多種雌激素靶器官中均可發現PELP1表達，其表達與細胞生物學功能相一致，且具有明顯差異性[1]。參與基因信號通路的PELP1主要于胞核中表達，PELP1與非基因通路相關，主要位于胞漿中。非基因通路與細胞的生長、凋亡、分化及增殖相關聯[2]。作為雌激素作用的重要靶點，雌激素調節因子PELP1與睪丸組織存在必然聯系。本文通過實驗做進一步研究，證實睪丸組織中是否存在PELP1表達，其表達與雌激素水平是否相關，與年齡是否存在差異。

1材料與方法

1.1主要試劑:DMEM培養液(有康恒業生物科技(北京)有限公司)、枸櫞酸鹽抗原修復液(福州邁新)、cDNA合成第一鏈試劑盒(日本Toyobo公司)、胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司)、總RNA提取試劑(北京博邁斯科技發展有限術公司)、HRP標記的羊抗-兔二抗(美國SouthernBiotech公司)、兔抗-PELP1抗體(圣克魯斯生物技術有限公司)、免疫組化試劑盒(上海佳和生物科技有限公司)、2×Trans Taq HIFI PCR SuperMixⅡ(北京全式金生物技術公司)。

1.2組織處理與實驗動物:切除實驗大鼠兩側睪丸，模擬雄性體內雌激素水平變化，建立動物模型。選取周齡為8的SD雄性大鼠24只，隨機分為3組，每組8只，既為對照組(A組)、去勢組(B組)，去勢后補充雌激素組(C組)。麻醉大鼠，空腹注射3%戊巴比妥鈉1.5mL/kg，對三組大鼠行開腹手術，僅摘除B、C兩組大鼠的睪丸。對C組大鼠進行皮下注射17β-雌二醇20μg·kg-1·d-1，給予B組大鼠生理鹽水作對照。術后對所有參與實驗的大鼠行常規飼養16周后，實施麻醉，摘取新鮮睪丸組織，于4%多聚甲醛液中固定，制作5μm蠟塊切片。所有參與實驗的動物均來自正規實驗動物管理中心。所有實驗操作均遵守動物實驗倫理原則和實驗動物技術規范。

1.3睪丸組織細胞的分離與培養:消化法獲得SD大鼠睪丸細胞。剪取新鮮SD大鼠睪丸組織，浸于含有0.1U/mL膠原酶和1U/mL胰酶的消化液中，孵箱37℃孵育45min。將消化后的組織接種于35mm含DMEM培養液的培養皿，37℃孵育過夜。培養24h后，更換新鮮培養液，去除懸浮組織與細胞。每3d換液一次，當細胞占瓶底≥80%時，取第3代細胞進行實驗。將睪丸細胞分為不同雌激素濃度處理組、不同雌激素作用時間組，并以雌激素抑制劑ICI-182-780為對照，收集細胞，檢測細胞中PELP1的表達。

1.4免疫組織化學:將睪丸組織切片PBS沖洗后，孵育于0.1%胰酶中，37℃孵箱孵育30min。將睪丸細胞以1×104個/cm2密度接種于蓋玻片，細胞貼壁生長后，取出蓋玻片，冷丙酮固定20min。免疫染色按照試劑盒說明書進行。切片或細胞3%雙氧水沖洗10min，1% TritonX-100預處理10min，充分沖洗后，一抗孵育(兔抗鼠PELP1,1:1000)，放入濕盒，4℃過夜。取出細胞或切片，室溫下復溫20min，二抗37℃孵育20min(羊抗兔IgG)，PBS沖洗后，DAB染色。顯微鏡觀察。

1.5實時定量PCR:使用總RNA提取試劑盒提取大鼠睪丸細胞RNA，實時定量PCR的方法檢測睪丸細胞中PELP1的表達。行反轉錄反應，檢驗體系中加入即將得到的cDNA模板，使用實時定量儀行Real-time PCR反應，檢測標準按照SYBR Premix Ex TaqTM II操作說明書。設計引物：β-actin：5’- CCTGGATAGCAACGTACATGG-3；5’- ACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’。PELP1：5’- TCACTGCCGAGAGACCCCCG-3’；5’- GGAAGATGGCGGCAGCCGTT-3’、

1.6Western-blot:胰酶消化法收集睪丸細胞，PBS沖洗后，置于RIPA裂解液中，冰上孵育10min，使細胞充分裂解，按照Beyotime細胞核蛋白抽提試劑盒說明，提取細胞全蛋白，并測定其濃度，所選用的試劑盒為Bradford試劑盒。在100℃的術中加入5×loading buffer，煮5min使變性。由于蛋白上樣量為40μg，所以用1×loading buffer按照40～30 μL進行蛋白調整，保證其相同體積，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。按預染的Marker切取所需目的條帶，切割范圍包含目的蛋白。轉膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，ECL顯影，放入培清JS-860A自動凝膠成像儀曝光。

1.7PELP1陽性細胞計數:光學顯微鏡視野下，選取PELP1陽性表達的細胞，數碼相機拍照，導入計算機，使用LUCIA G圖像分析軟件，計算陽性細胞表達數。保證每組數據測量3次。通過SPSS 12.0軟件的使用對數據進行分析，采用“Tukey檢驗”進行多組間兩兩比較；采用“一維方差分析”進行兩組間比較，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1檢測血清雌激素水平:手術前和接受雌激素治療18周后，OVX大鼠接受雌激素水平如下表。A組與C組之間無明顯區別(P>0.05)；與A和C組相比，B組血清雌激素水平明顯偏低(P<0.05)，(見表1)。

2.2PELP1在大鼠睪丸中的表達:陽性對照組為大鼠子宮(圖1)，在大鼠睪丸組織中可見PELP1表達，PELP1為棕色顆粒，在胞核胞漿中可見均(圖2)，胞漿表達最多(圖3)。

圖1

圖2

圖3

行免疫組化染色，記錄每組組織切片陽性細胞數(平均陽性細胞率±標準差)。本文研究結果顯示，雌激素水平不同時，PELP1陽性細胞率亦存在區別，差異具有統計學意義(P<0.05)；OVX組

2.3雌激素上調PELP1在大鼠睪丸細胞中的表達:與對照組相比，睪丸細胞中PELP1在雌激素刺激下的表達升高(Fig.3A3B)。在進一步的實驗中發現，睪丸細胞中PELP1的表達隨著雌激素作用濃度的提高而表達增加(Fig.3D)，隨著雌激素作用時間的增加而表達增加(Fig.3C)，與雌激素的濃度、時間刺激呈正相關。

3討論

內源性雌激素是雄性生殖細胞存活因子的一種，在雄性動物體內，內源性雌激素主要來自局部細胞的自分泌和旁分泌[3]。內源性雌激素主要存在于雄性動物的精液中，且濃度較高，在睪丸網液中達250ng/L，與雌性動物血清中雌二醇的濃度相比，明顯偏高。睪丸內的雌激素主要由芳香化酶催化產生，而芳香化酶的基因突變會使男性睪丸小或隱睪、生精細胞缺如、無精子或精子密度顯著降低、死精等癥狀。

研究表明，睪丸中雌激素受體高表達，雌激素與雌激素受體形成復合體，間接影響生殖器的發育和發生，直接參與睪丸間質細胞雄激素的釋放與合成，調節睪丸的生殖功能[4]。雌激素受體具有調節作用，其調節途徑主要有兩種：非基因通路和基因通路，參與細胞的凋亡、增殖和生長，以及雌激素相關的組織保護功能相關。實驗已證明雌激素受體基因敲除的小鼠，出生后睪丸正常，但青春期睪丸開始變性，成年后睪丸萎縮，精子發生障礙和精子密度顯著降低并不育。

PELP1在雌激素靶器官中廣泛存在與表達[5]。研究表明，細胞內PELP1的不同表達與定位，使PELP1發揮不同的雌激素受體調節作用。PELP1在在胞膜與胞漿中少量存在，在腦組織中與ER共表達胞核。在肌細胞和表皮細胞中，ER僅與PELP1共同定位于胞核，胞漿中無表達。本實驗發現，PELP1主要表達于睪丸細胞胞漿中，提示PELP1的表達具有細胞特異性。本實驗發現睪丸中PELP1蛋白與雌激素的相關性：①PELP1蛋白的表達與雌激素直接相關；②雌激素在基因與蛋白水平上調PELP1的表達；③PELP1的表達與雌激素的作用時間和濃度呈正相關，由此可知PELP1可能與睪丸細胞凋亡、增殖及生長有關，對睪丸組織可能具有保護作用。

【參考文獻】

[1]李江源.精子發生的內分泌因素調節[J].生殖醫學雜志,2014,23(9):697～702.

[2]傅冷西,李篤妙,張健星,等.隱睪癥中激素和雌雄激素受體的研究[J].中華小兒外科雜志,2005,26(4):186～188.

[3]劉永杰,常青,白剛,等.無精子癥患者FSH、LH與外周血和睪丸組織T、E2、T/E2相關性的研究[J].中國男科學雜志,2014,4(1):23～26.

[4]吳建云,王鮮忠,孫燕,等.雌激素β受體在大鼠睪丸中的表達與發育研究[J].實驗研究,2010,2(9):6～8.

[5]Jonsson D, et al.The human periodontal ligament cell: a fibroblast-like cell acting as an immune cell[J].Periodontal Res, 2011,46(2):153～157.

【基金項目】中國人民解放軍總醫院苗圃基金面上項目，(編號：15MM39)

【文章編號】1006-6233(2016)06-0986-03

【文獻標識碼】A【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.06.040