影響乳酸菌平板菌落計數(shù)的方法研究

李穎　李婷

【摘要】 目的 研究不同涂布方法與平板放置時間對于平板菌落計數(shù)法的影響， 為微生物計數(shù)研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。方法 分別比較圓形、井字、先圓形后井字和90°轉(zhuǎn)動平板橫線涂布方法以及平板放置3、6、9 h和12 h對于副干酪乳桿菌在乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS）平板菌落計數(shù)的影響， 并做分析。結(jié)果 不同涂布方法對于活菌數(shù)的影響不明顯， 而對于同一涂法方法來說， 平板放置12 h后， 微生物生長的菌落數(shù)最低。不同涂布方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均大約在10%以內(nèi)。結(jié)論 在涂布平板做乳酸菌菌落計數(shù)時， 同一稀釋度下， 無論以何種涂布方式， 將菌液均勻涂開即可達到菌落計數(shù)目的， 但是菌落計數(shù)的最佳范圍應(yīng)該在平板放置6～9 h以內(nèi)。

【關(guān)鍵詞】 平板菌落計數(shù)法；平板放置時間；平板涂布方法

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.16.196

平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋， 在規(guī)定的條件下培養(yǎng)后， 所得1 ml或1 cm2樣品中含菌落的總數(shù)。一般認為， 一個肉眼可見的菌落代表原樣品中的一個單細胞。選擇合適的稀釋度并乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)就可以獲得樣品中微生物的數(shù)量[1]。平板菌落計數(shù)法以其重復(fù)性好， 能真實地反應(yīng)樣品中活菌數(shù)量的優(yōu)勢成為我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的公認可行的方法， 并且在食品藥品研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。尤其在醫(yī)藥方面， 控制口服制劑中微生物的污染狀況是藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)， 也是評價企業(yè)各生產(chǎn)環(huán)節(jié)衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)[2]。另一方面， 平板菌落計數(shù)法也可用于檢測活菌制劑類藥物的活菌數(shù)量。乳酸菌是食品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中被廣泛應(yīng)用的菌株之一， 其活菌數(shù)的多少直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和功能。因此， 研究乳酸菌的平板菌落計數(shù)法的影響因素有助于提高其檢測的準(zhǔn)確程度， 進而有效控制藥品制作中微生物數(shù)量， 提高產(chǎn)品品質(zhì)。現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g， 牛肉膏5 g， 酵母粉5 g， 胰蛋白胨10 g， 吐溫（Tween）-80 1 ml， 葡萄糖20 g， 磷酸氫二鉀2 g， 檸檬酸氫二銨2 g， 乙酸鈉5 g， 硫酸鎂0.5 g， 硫酸錳0.25 g， 蒸餾水定容至1000 ml， 調(diào)節(jié)pH值至5.8， 121℃滅菌15 min， 用于菌體的活化。MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基添加2%（W/V）的瓊脂粉， 121℃滅菌15 min， 用于菌落計數(shù)。BCN1360型生物潔凈工作臺；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1. 2 方法 菌體的活化從-80℃取出嗜酸乳桿菌復(fù)蘇純化， 37℃、14 h活化兩代。

1. 2. 1 菌懸液的制備 將上述活化后的第三代嗜酸乳桿菌菌液用0.85% （W/V） 的無菌氯化鈉溶液分別梯度稀釋至10-5、10-6、10-7， 備用。

1. 2. 2 涂布方法及平板放置時間的影響檢測 分別采用圓形、井字、先圓形后井字和90°轉(zhuǎn)動平板橫線4種涂布方法， 將10-5、10-6、10-7三個稀釋度的菌液涂布在分別放置了3、6、9、12 h的MRS平板上。37℃培養(yǎng)48 h后， 挑選菌落數(shù)在30～300的平板計數(shù)。

2 結(jié)果

2. 1 不同涂布方法對于活菌數(shù)的影響不明顯， 而對于同一涂布方法來說， 平板放置12 h后， 微生物生長的菌落數(shù)最低。見圖1。

2. 2 通過觀察發(fā)現(xiàn)不同涂布方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均大約在10%以內(nèi)。見表1。

3 討論

“2. 1結(jié)果”可能是由于培養(yǎng)基在放置12 h后內(nèi)部的水分活度沒有其他時間段利于微生物的生長[3]。由于在試驗過程中發(fā)現(xiàn)平板放置3 h時培養(yǎng)基表面較滑， 不利于涂布操作。綜合考慮， 選擇放置6～9 h的平板更適于菌落計數(shù)。

測定樣品中的菌數(shù)方法主要有顯微鏡直接計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法、濁度測量法、粒子計數(shù)法、三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光法、電阻抗測量法、放射測量法、接觸酶測量法等。這些方法都存在各自的適用范圍及優(yōu)缺點。平板菌落計數(shù)法具有能檢測出活菌數(shù)， 更真實地反映樣品狀況以及重復(fù)性好， 樣品中菌數(shù)高或低都適用的特點， 因此在藥品研究及實踐中廣泛應(yīng)用。但是對于平板菌落計數(shù)法的影響因素研究卻甚少， 通過本研究發(fā)現(xiàn)， 涂布方法對于平板菌落計數(shù)的影響是不顯著的。相反， 平板的放置時間對于最終菌落計數(shù)的結(jié)果有顯著性影響， 當(dāng)培養(yǎng)基放置時間過長（>12 h）時， 水分活度的改變會影響所培養(yǎng)微生物的生長。這利于提高平板菌落計數(shù)的準(zhǔn)確性， 對更好地控制食品、藥品中微生物的數(shù)量具有重要意義。

參考文獻

[1] 李華. 平板菌落計數(shù)的改進方法. 生物學(xué)通報， 2006， 41（1）：51-54.

[2] 張松青， 王鑫， 鄭笠. 麻荊止咳顆粒微生物限度檢查方法的建立. 海峽藥學(xué)， 2014， 12（34）：78-79.

[3] 周康， 劉壽春， 李平蘭， 等. 食品微生物生長預(yù)測模型研究新進展. 微生物學(xué)通報， 2008， 35（4）：589-594.

[收稿日期：2016-03-14]