胰高糖素肽-1對軟脂酸培養中胰島細胞的影響

中國醫科大學附屬第四醫院內分泌科(沈陽110032 )

王　露　張　丹　史　亮　王　薇　楊麗剛

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胰高糖素肽-1對軟脂酸培養中胰島細胞的影響

中國醫科大學附屬第四醫院內分泌科(沈陽110032 )

王露張丹史亮王薇楊麗剛

摘要目的：探討胰高糖素樣肽-1(GLP-1)對軟脂酸培養下胰島細胞的影響。方法：體外培養胰島細胞INS-1，將其分為空白對照組、軟脂酸組(0.25 mmol/L)及GLP-1作用組(濃度分別為10nmol/L，20nmmol/L，30nmol/L)，培養24h后，取上清測定胰島素水平及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量。結果：軟脂酸可使胰島素分泌量減少，GSH-Px濃度下降，MDA含量增加，GLP-1可以明顯抑制軟脂酸引起的上述變化，抑制作用隨GLP-1濃度的增加而增強。結論：胰高糖素樣-1(GLP-1)對軟脂酸導致的胰島細胞損傷有一定的保護作用，并且呈濃度依賴性。

主題詞胰高糖素樣肽-1谷胱甘肽過氧化物酶丙二醛細胞培養技術

胰高糖素樣肽-1(GLP-1)以葡萄糖依賴的形式促進體內胰島素的分泌，且能刺激胰島β細胞的增殖和新生β細胞的分化，抑制其凋亡，從而增加胰島β細胞的數量，改善胰島β細胞功能，進一步延緩體內胰島β細胞的衰竭[1-2]。 “脂毒性”是指血循環中游離脂肪酸濃度過高以及脂肪組織分泌的各種脂肪素含量增高所引起的致糖尿病作用。脂毒性對胰島β細胞的數量和功能均可產生不利影響。有研究表明，軟脂酸可以導致胰島素分泌減少[3]，而應用胰高糖素樣-1能否減輕此反應也不完全清楚。本實驗應用軟脂酸培養胰島細胞，并進一步探討胰高糖素樣-1對此的影響。

材料與方法

1材料細胞株和試劑：大鼠胰島細胞株INS-1(武漢大學細胞庫)，軟脂酸購于美國Calbiochem公司，GLP-1(Sigma公司，美國);放射免疫法測定試劑盒購自解放軍總醫院科技開發中心放免研究所。

2方法

2.1細胞培養：大鼠胰島細胞株INS-1培養于含10%FBS的RPMI1640 培養基中(含10%mmol/L Hepes, 1mmol/L丙酮酸鈉，50μmol/L 2- 巰基乙醇，100U/ml青霉素和100μg/ml 的鏈霉素)，置于37%℃，5%CO2飽和濕度培養箱常規培養，將處于對數生長期貼壁生長的INS-1 細胞用0.25%胰酶消化離心，用RPMI1640培養液制成單細胞懸液，并校正細胞濃度至1×106/ml。分別將iNS-1細胞按1×105個/ml種植于24孔板內，分為①正常對照組; ②軟脂酸組(0.25 mmol/L);③GLP-1低劑量組：軟脂酸0.25 mmol/L+10nmol/L GLP-1;④GLP-1中劑量組：軟脂酸0.25mmol/L+ 20nmol/L GLP-1;⑤GLP-1高劑量組：軟脂酸0.25 mmol/L +30nmol/L GLP-1。孵育24h收集上清液，-20°C保存。

2.2胰島素含量:采用放免法測定。

2.3GSH-Px、MDA含量：采用比色法測定。

結果

1胰島素含量的比較單用軟脂酸培養組的胰島素水平較對照組明顯降低(P﹤0.05)，加用GLP-1干預后胰島素水平較單用軟脂酸組明顯增加(P﹤0.05)，隨GLP-1濃度增加改善作用逐漸增強，見附表。

2GSH-Px、MDA含量的比較單用軟脂酸培養組的GSH-Px含量較對照組明顯降低(P﹤0.05)，加用GLP-1干預后明顯改善(P﹤0.05)，隨GLP-1濃度增加改善作用逐漸增強。與對照組比較，單用軟脂酸培養組的MDA含量明顯增加(P﹤0.05)，經GLP-干預后明顯得到抑制(P﹤0.05)，隨GLP-1濃度增加抑制作用逐漸增強，見附表。

附表　各組胰島素及GSH-Px、MDA含量的比較

注： 與對照組比較，#P﹤0.05 ，與軟脂酸組比較，*P﹤0.05

討論

本研究應用軟脂酸培養胰島細胞發現胰島素水平明顯降低，進一步證明了游離脂肪酸對胰島細胞脂毒性的作用，脂毒性可以誘導胰島細胞凋亡[4]，影響胰島素分泌。李麗英等[5]也發現將大鼠胰島β細胞置入含有過氧化氫的環境中后, 胰島β細胞的增值活性、存活率和胰島素分泌能力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高。這其中的機制，目前比較公認的是由于內質網應激和氧化應激[6]。胰島是所有組織中對氧化應激最敏感的組織,胰島中抗氧化酶的含量在所有組織中是最低的。本實驗也研究發現軟脂酸培養組的GSH-Px含量明顯減低，MDA含量明顯增加，表明軟脂酸組氧化應激水平明顯增加。氧化應激時過剩的活性氧族可以直接對脂質、蛋白、溶酶體、DNA造成氧化損傷，大量氧自由基可使細胞膜脂質過氧化,線粒體膜形狀改變,導致線粒體功能障礙,生成減少,使質膜和肌漿網膜的鈣泵失活,導致細胞內游離的鈣離子增多,激活磷脂酶活性,使膜磷脂分解,導致β細胞凋亡。

胰高糖素樣肽-1的應用是否能保護胰島細胞功能，到目前為止國際上也開展了各種研究。臨床在應用GLP-1類似物治療2型糖尿病患者后，可觀察到載脂蛋白B/載脂蛋白A1比值顯著降低，從而改善高脂血癥[7]。但體外研究對GLP-1影響脂質代謝仍存有爭議，認為其對脂質合成和脂質分解作用呈雙重作用。有研究[8]表明，GLP-1能夠增加脂肪細胞表明胰島素受體和胰島素底物(IRS-1)數量，促進GLUT-4的表達，從而改善胰島素抵抗。而胰高糖素樣-1是否能保護胰島細胞，目前研究很少，本研究發現應用不同濃度的GLP-1與軟脂酸共同培養胰島細胞時，可明顯改善軟脂酸所致的胰島細胞損傷，并且這種保護作用隨GLP-1的濃度的增加而增強。這其中的原理可能是，GLP-1能夠抑制胰島β細胞因暴露于炎癥因子、高糖及游離脂肪酸等引起的細胞凋亡，拮抗β細胞因不良環境引起的損害并促進前體細胞分化為β細胞[9]，且有學者在動物實驗中發現GLP-1能夠降低糖尿病鼠的氧化應激水平從而減少β細胞的凋亡并促進前體細胞分化為β細胞[10]。在本實驗中就發現加入GLP-1培養后，GSH-Px含量明顯增加，MDA含量明顯降低，并隨濃度增加，這種改變逐漸顯著。

本研究發現胰高糖素樣肽-1顯著改善了由軟脂酸造成的胰島細胞分泌減少和氧化應激水平增加，這不僅說明氧化應激在胰島功能損傷中起一定作用，同時也為改善胰島功能損傷的治療提供了一條思路。

參考文獻

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(收稿:2015-07-23)

【中圖分類號】R392.6

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.03