抗CD20單克隆抗體與IL-10基因聯合應用對NOD鼠肝臟PDX-1的影響

范 磊 李 誠 李 堂

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抗CD20單克隆抗體與IL-10基因聯合應用對NOD鼠肝臟PDX-1的影響

范 磊 李 誠 李 堂

【摘要】目的 察抗CD20單克隆抗體與IL-10基因聯合應用于已發病的NOD鼠，觀察對其肝臟中PDX-1表達的影響。方法 17-20周齡雌性發病的NOD小鼠24只，隨機分為A、抗CD20單克隆抗體組（于發病第1 d尾靜脈注射Anti-CD20 500 μg，并于第3、6、9 d尾靜脈注射Anti-CD20 250 μg）；B、抗CD20單克隆抗體+IL-10基因組（第1 d尾靜脈注射Anti-CD20 500 μg + IL-10基因0．1 ml，后相同時間尾靜脈注射Anti-CD20 250 μg + IL-10基因0．1 ml）；C、IL-10基因組（IL-10基因0．1 ml）；D生理鹽水對照組（生理鹽水0．1 ml）。發病后每周監測2次體重；每天同一時間監測血糖，若血糖≥25 mmol/L，按20 U/kg皮下注射來得時。觀察6周后行免疫組化檢測肝臟中PDX1蛋白相對表達量，并行PCR了解PDX-1基因表達情況。結果 聯合治療組肝臟中PDX-1基因表達及蛋白表達水平高于其他組，差異有統計學意義（P＜0．05）。結論 抗CD20單克隆抗體與IL-10基因組聯合干預可提高可促進PDX-1的表達。

【關鍵詞】抗CD20單克隆抗體；白細胞介素10；胰腺-十二指腸同源框1；肝臟；1型糖尿病

Objective To observe the influence of liver PDX-1 expression in NOD mice after interfered by anti-CD20 monoclonal antibody combined with inter-leukin10． Methods Twenty-four female NOD mice（17-20weeks old）were randomly divided into four groups：A Anti-CD20，B Anti-CD20+IL-10，C IL-10 and D Normal Control（NC）groups． The first time group A and B were respectively injected of 500 μg Anti-CD20 antibody，combined 500 μg Anti-CD20 antibody． After the 3、6、9 day，group A、B、C、D were injected of 250 μg Anti-CD20 antibody，combined 250 μg Anti-CD20 antibody，0．1 ml IL-10 and 0．1 ml physiological saline． All mice were twice weekly monitored for weight，and monitored for blood glucose at the same time everyday． After 6weeks，the local expression of PDX-1 were observed by immunohistochemistry． The gene expression of PDX-1 were observed by PCR． Results After combined Anti-CD20 and IL-10 intervention，the liver PDX1 expression was upregulated（P＜0．05）．Conclusion The combined administration of Anti-CD20 and IL-10 increased increased the expression of PDX1 in the liver．

【Key words】 Anti-CD20 antibody，Interleukin 10，PDX-1，Liver，T1DM

1型糖尿病（T1DM）是一種嚴重危害青少年健康一種自身免疫性疾病，且發病率呈上升趨勢。目前終生胰島素注射治療仍為治療的主要手段，即使胰島素制劑及用法不斷改善，仍給患兒的生活帶來很大不便，因此尋求胰島β細胞的再生，延緩胰島炎的進程，保護殘存胰島β細胞功能，成為研究T1DM治療的熱點之一。目前認為1型糖尿病病情進展過程與Th1/Th2失衡有關［1］，且β細胞在發病過程中亦發揮著重要作用。NOD鼠因遺傳學特征和免疫學特征與人類近似被認為是1型糖尿病的最佳實驗模型。NOD鼠通常于4～5周開始出現胰島炎，并進行性破壞，于12周齡時開始出現糖尿病癥狀，到30周齡時累計發病率可高達80%［2］。

在胚胎發育時期，胰腺和肝臟來源于相鄰區域的內胚層，肝臟被認為是產胰島素細胞的潛在來源［3］。其中胰腺-十二指腸同源框1（PDX-1）在胰腺的發育以及胰島素分泌過程中都扮演了重要的角色。有研究發現［4］利用轉分化技術，在肝實質中表達修飾過的PDX-1基因，可使肝臟細胞分化成為具有內分泌和外分泌活性的胰腺細胞。本課題組前期實驗表明［5］，抗CD20單克隆抗體與IL-10聯合應用可以減輕胰島β細胞的凋亡和損傷。由于肝臟對機體糖脂代謝起著重要作用，所以本實驗聯合應用抗CD20單克隆抗體與IL-10基因作用于NOD鼠觀察其對肝臟中PDX-1表達的影響。由于IL-10半衰期極短，不適合直接應用，本課題組前期已經成功構建了攜帶有鼠IL-10基因的重組腺病毒載體［6］，并發現其感染胰島素分泌細胞，細胞內可有效表達IL-10。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雌性NOD鼠24只，17～20周齡，由常州卡文斯實驗動物有限公司，SPF級，飼養于青島大學附屬醫院動物實驗中心，12 h明暗交替，溫度23℃左右，濕度60%左右，不限飲食。飼養期間每周固定時間監測隨機血糖2次，隨機血糖連續2次＞13.9 mmol/L時，即診斷為糖尿病。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組腺病毒擴增及滴度測定 當80%左右的HEK293細胞（美國ATCC細胞庫）貼壁時感染腺病毒，棄細胞原培養液，加入2 ml培養液、200 μl攜有IL-10基因的重組腺病毒液，于二氧化碳培養箱中培養24～48 h，倒置顯微鏡下觀察到＞80%細胞出現綠色熒光時收獲病毒液，離心棄上清，加入PBS液，反復離心、凍融后留取上清。96孔培養板中接種HEK293細胞，并根據腺病毒感染性滴度試劑盒（快速檢測）說明操作，測定重組腺病毒滴度。

1.2.2 分組 將24只NOD鼠經隨機分為：A、抗CD20單克隆抗體組，B、抗CD20單克隆抗體 + IL-10基因組，C、IL-10基因組，D、NC組。第1 d，組A、B經尾靜脈注射的抗CD20單克隆抗體首次計量加倍為500 μg，后分別于第3、6、9 d尾靜脈給予抗CD20單克隆抗體250 μg、抗CD20單克隆抗體250 μg + IL-10基因0.1 ml，IL-10基因0.1 ml、生理鹽水0.1 ml，抗CD20單克隆抗體首次計量加倍。發病后每周監測2次體重；發病后每天同一時間測量血糖，血糖≥25 mmol/L，按20 U/kg皮下注射來得時。觀察6周后，腹腔注射水合氯醛麻醉，將老鼠斷頸處死，無菌剪剪開腹腔，分離出肝臟。

1.2.3 PDX-1 mRNA檢測 采用RT-PCR法，用超純RNA提取試劑提取組織樣本中總RNA。取5 μl RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性。用反轉錄試劑盒中的gDNA Eraser對RNA中殘留的基因組DNA進行消化處理。用反轉錄試劑盒進行反轉錄。PCR反應體系為：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、cDNA 10倍稀釋后取2 μl、滅菌雙蒸水4.5 μl（總體積20 μl）。PCR擴增的溫度條件：95℃ 30 s，（95℃ 5 s，60℃ 34 s）×40個循環。引物序列：上游：5，-GGAGGAGAATAAGAGGAC-3，，下游：5，-GAACCAGATTTTGATGTG -3，，PCR產物為154 bp。內參序列：上游：5，-CGTATCGGACGCCTGGTT-3，，下游：5，-GTGCCGTTGAACTTGCCG-3，，PCR產物為140 bp。取5 μl RNA，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，根據Real-Time PCR原始檢測結果，按照2-△△ct相對定量計算公式，計算出各樣品的目的基因相對定量結果，即其他各個樣品相對于對照樣品，目的基因mRNA轉錄水平的差異

1.2.4 免疫組化檢測肝臟中PDX-1的相對量的表達 將肝臟石蠟切片依次行抗原修復、滅活酶、封閉、抗原-抗體反應、加增強劑、一抗二抗反應、顯色、終止顯色、復染、脫水封固等系列操作后于光學顯微鏡下觀察組織細胞中的表達情況。選取5個高表達區域拍照保存。陽性細胞為胞漿內有棕黃色顆粒沉積。評分標準：A為陽性細胞數分級0%～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B為陽性細胞顯色強度分級0（陰性）、1（弱陽性）、2（陽性）、3（強陽性）。IHS=A×B［8］。

1.2.5 統計學方法 實驗數據用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以（x-±s）表示，對數據進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，對不符合正態性檢驗的數據予數據轉化，多組間數據比較采用方差分析和LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝臟免疫組化檢測PDX-1表達水平

與對照組相比，Anti-CD20組、Anti-CD20+IL-10組、IL-10 組PDX-1蛋白表達均較高，且P＜0.05，有統計學意義；與Anti-CD20組相比，IL-10組、Anti-CD20+IL-10組PDX-1基因表達較高，且P＜0.05，有統計學意義；但Anti-CD20+IL-10組與IL-10組相比較無統計學意義。PDX-1免疫組化染色產物位于胞漿，呈棕褐色顆粒，（具體見圖1、表1）。

圖1 Anti-CD20與IL-10聯合治療對NOD鼠肝臟PDX-1表達水平的影響（免疫組化染色，×400）

表1 各組免疫組化肝臟PDX-1的相對量的表達（±s，mmol/L）

表1 各組免疫組化肝臟PDX-1的相對量的表達（±s，mmol/L）

注：與NC組相比，*P＜0．05；與Anti-CD20組，#P＜0．05；與IL-10組，△P＞0．05

組別　鼠數　PDX-1 Anti-CD20組Anti-CD20+IL-10組IL-10組NC組6666 42．5±14．167*117．5±11．912*#△118．5±10．173*#11．8±3．601

2.2 Real-Time PCR檢測肝臟中PDX-1基因表達量

與對照組相比，Anti-CD20組、Anti-CD20+IL-10組、IL-10 組PDX-1基因表達均較高，且P＜0.05，差異有統計學意義；較Anti-CD20組、IL-10組，聯合組PDX-1基因表達較高，且P＜0.05，差異有統計學意義；但Anti-CD20組與IL-10組相比較差異無統計學意義，（具體見表2，圖2）。

表2 各組PCR檢測肝臟PDX-1基因表達量（±s，mmol/L）

表2 各組PCR檢測肝臟PDX-1基因表達量（±s，mmol/L）

注：與NC組相比，*P＜0．05；與Anti-CD20組，#P＜0．05；與IL-10組，△P＞0．05

組別　鼠數　PDX-1 Anti-CD20組Anti-CD20+IL-10組IL-10組NC組6666 1．319±0．242*1．727±0．202*#△1．307±0．243*0．706±0．346

圖2 PCR檢測肝臟PDX-1基因擴增曲線

3 討論

1型糖尿病是在多種遺傳因素和環境因素相互作用下，引發自身免疫功能紊亂，導致胰島β細胞進行性損傷和胰島素分泌絕對不足為基礎的自身免疫性疾病。人們普遍認為輔助性T淋巴細胞在1型糖尿病的發病中起中心性作用，Th1/Th2細胞亞群的失衡是該病發病的關鍵［9］。IL-10主要由Th2細胞分泌，作為一種多效性細胞因子，具有抗炎及免疫抑制特性，可抑制自身免疫反應過程中炎性因子釋放，抑制抗原提呈等多個環節，并可促進β細胞分化［10］。實際上β細胞在1型糖尿病的發生及發展過程中也起著重要作用。最近有研究表明存在β細胞缺陷的NOD鼠給予抗體治療后，NOD小鼠不會發生胰島炎及1型糖尿病［11］。CD20 是β細胞細胞膜表面特異性的細胞因子之一，它表達于pre-β細胞階段，并參與β細胞活化過程。抗CD20單克隆抗體是針對β淋巴細胞表面CD20分子的單克隆抗體，能夠與細胞表面CD20分子高親和力結合，可導致被結合的β淋巴細胞清除，使體內β淋巴細胞的數量減少［12-13］。2009年11月公布的一項Ⅱ期臨床實驗中表明，應用抗CD20單克隆抗體（利妥昔單抗）可使β細胞耗竭，在1年內胰島素需求量和HbA1c比對照組降低［14］。但是由于抗CD20單克隆抗體對體內β淋巴細胞的清除作用，使得機體在一定時期內β淋巴細胞的數量維持在較低水平，從而對免疫功能造成一定的影響。最近就有研究指出，消除調節性β細胞可引起潰瘍性結腸炎急性發作，與局部IL-10產生降低有關［15］。本課題組前期研究發現，IL-10通過抑制β細胞表面Fas表達而起到抗凋亡作用［15］。將IL-10與CD20單克隆抗體聯合使用，盡可能規避抗CD20單克隆抗體的副作用。

肝臟是三大物質代謝的主要場所，也是胰島素作用的三大臟器之一，且胰島素又反饋性調節肝臟的糖脂和氨基酸的代謝方向，因此糖尿病肝臟胰島素信號通路的改變可能是肝臟參與糖尿病發病機制的重要方式。在胚胎發育至第4周時，形成原始腸管，即前腸、中腸和后腸。在前腸尾端腹側靠近卵黃囊管處，內胚層增厚，稱肝憩室，即肝和膽道的原基。由于胰腺和肝臟均來源于相鄰區域的內胚層，肝臟被認為是產胰島素細胞的潛在來源［3］。人們早在發生肝硬化的肝臟組織中發現了類似胰腺外分泌細胞的腺泡細胞，間接證明了肝臟向胰腺自然轉化的存在。肝臟內有類胰腺內分泌前體細胞，可以表達與胰腺內分泌細胞發育相關的胰島素轉錄因子如PDX-1，ngn3等。PDX-1大多分布于產胰島素的β細胞及分泌生長抑素的δ細胞中，也散在分布于十二指腸和發育的腦中的一些內分泌細胞中。PDX-1在胰腺的發育中有重要作用，它是胰腺發育必需的轉錄因子，在內分泌腺前體細胞分化為胰島β細胞過程中起著關鍵作用。有研究表明在PDX-1基因敲除的小鼠中，未發現成熟的胰島細胞，生后很快發生高血糖癥［16］。本課題組前期實驗發現，將抗CD20單克隆抗體與IL10聯合應用，可降低NOD鼠的血糖［5,7］，遂本實驗中通過PCR檢測肝臟PDX-1基因表達及免疫組化檢測PDX-1蛋白的相對表達量，發現聯合應用可促進肝臟中PDX-1的表達，這或者為外源性胰島素的產生提供新的研究途徑。

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Effect of Combined Application With Anti-CD20 Antibody and Interleukin-10 Gene on Liver PDX-1 Expression in NOD Mice

FAN Lei LI Cheng LI Tang Qingdao University，Qingdao 266071，China

【Abstract】

【中圖分類號】R3

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）05-0196-04

doi:10．3969/j．issn．1674-9316．2016．05．143

作者單位：266071 青島大學

通訊作者：李堂，E-mail：drlitang@hotmail．com

基金項目：國家自然科學基金（項目編號：81170762）