多發(fā)性骨髓瘤免疫表型特征及其臨床意義

張翠萍，汪鵬，李慶，徐修才，胡超杰，鄭南

( 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 中心實驗室，b 腎臟內(nèi)科，合肥230001)

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·論著·

多發(fā)性骨髓瘤免疫表型特征及其臨床意義

張翠萍a，汪鵬b，李慶a，徐修才a，胡超杰a，鄭南a

( 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 中心實驗室，b 腎臟內(nèi)科，合肥230001)

[摘要]目的探討流式細(xì)胞術(shù)檢測多發(fā)性骨髓瘤(MM)的免疫表型特征及其臨床意義。方法應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(MP-FCM)，采用CD138/CD45/SSC設(shè)門，檢測40例MM患者和20例正常獻(xiàn)髓者骨髓細(xì)胞免疫表型。結(jié)果MM患者抗原異常表達(dá)率由高到低分別為CD45dim+/-(95%)、CD81dim+/-(80%)、CD56+(70%)、CD27dim+/-(50%)、CD200++(48%)、CD33+(40%)、CD28++(35%)、CD117+(18%)、CD19+(5%)和CD20+(3%)。CD56+、CD200dim+、CD28dim+在正常漿細(xì)胞的表達(dá)率分別為10%、10%和5%。結(jié)論應(yīng)用MP-FCM檢測MM細(xì)胞免疫表型,可準(zhǔn)確地鑒別良惡性漿細(xì)胞，有助于MM的診斷、預(yù)后判斷及靶向治療。

[關(guān)鍵詞]多發(fā)性骨髓瘤；免疫表型分型; 漿細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是骨髓內(nèi)單一漿細(xì)胞株異常增生，并伴單克隆免疫球蛋白增多和溶骨性病變?yōu)樘卣鞯囊环N惡性腫瘤。多發(fā)于中老年人，臨床表現(xiàn)多樣。由于骨髓病變呈灶性分布，漿細(xì)胞達(dá)不到診斷標(biāo)準(zhǔn)，或為不分泌型，且部分骨髓瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增多的漿細(xì)胞與正常漿細(xì)胞在形態(tài)上難以區(qū)別，因此診斷較為困難。近年來，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(MP-FCM)在MM診斷、治療和療效觀察等方面的價值日益突出。國內(nèi)一般通過四色免疫熒光MP-FCM測定MM患者骨髓細(xì)胞的免疫表型，本實驗室采用八色流式細(xì)胞術(shù)分析其免疫表型特點，為臨床明確診斷和預(yù)后判斷提供重要的實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1病例資料收集安徽省立醫(yī)院2013-2015年住院的40例初診MM患者，均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第2版診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。其中男27例，女13例；年齡32～77歲，中位年齡60.5歲；免疫球蛋白類型IgG型22例，IgA型11例，IgD型2例，輕鏈型5例；按照Durie-Salmon分期診斷標(biāo)準(zhǔn)I期1例，Ⅱ期10例，Ⅲ期29例。20例健康對照組均為志愿獻(xiàn)髓者，男12例，女8例，年齡21～48歲，中位年齡34歲。

1.2主要儀器和主要試劑流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司的FACS Canto Ⅱ型。熒光標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體包括CD138、CD38、CD19、CD56、CD81、CD22、CD20、CD27、CD117、CD28、CD33、CD34、CD200、CD45，以及各自對應(yīng)的同型陰性對照試劑，紅細(xì)胞裂解液，破膜劑均購自美國Becton Dickinson公司，抗Kappa-FITC /Lambda -PE組合抗體(克隆號FR481)購自丹麥DAKO公司。

1.3檢測方法EDTA抗凝的新鮮骨髓液送檢后于4 h內(nèi)按八色免疫熒光直接標(biāo)記方法，分別進(jìn)行細(xì)胞膜表面和胞漿內(nèi)染色。染色前用PBS洗2次，去除親細(xì)胞抗體。處理后的標(biāo)本在2 h內(nèi)上機(jī)檢測，用BD FACS Diva軟件獲取500 000個細(xì)胞，對數(shù)取樣。正確的設(shè)門策略是分析漿細(xì)胞表型的關(guān)鍵。本實驗采用CD138/CD45/SSC聯(lián)合設(shè)門，圈出CD45+或CD45dim+/-CD138+細(xì)胞群(P2)，分析該群細(xì)胞(P2)的抗原表達(dá)情況,見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果以熒光強(qiáng)度<102為陰性(-)，102～103范圍內(nèi)為弱陽性(dim+)，103～ 104范圍內(nèi)為陽性(+)，大于104為強(qiáng)陽性(++)。抗原表達(dá)>20%確定為抗原陽性。

2結(jié)果

2.1骨髓中漿細(xì)胞比例MM患者骨髓標(biāo)本采用CD138/CD45/SSC設(shè)門后，可見CD45dim+/-CD138+區(qū)域有一群異常細(xì)胞，該群細(xì)胞占全部有核細(xì)胞的比例在3.5%～88.9%(中位值為17.55%)。同時送檢的骨髓涂片中原幼稚漿細(xì)胞的比例在1.5%～77.5%(中位值為16.5%)。20例正常對照骨髓，CD45+/ CD138+區(qū)域有微量細(xì)胞群，該細(xì)胞占全部有核細(xì)胞的比例在0.01%～0.42%(中位值為0.18%)。

2.2MM患者異常漿細(xì)胞免疫表型利用MP-FCM同時檢測胞膜抗原CD38、CD138、CD45、CD19、CD56、CD81、CD200、CD27、CD28、CD117、CD20、CD33，以及胞膜和胞漿免疫球蛋白輕鏈(kappa/Lambda)的表達(dá)情況，可見多項抗原表達(dá)異常。MM中抗原異常表達(dá)率由高到低分別為CD45dim+/-(95%)、CD81dim+/-(80%)、CD56+(70%)、CD27dim+/-(50%)、CD200++(48%)、CD33+(40%)、CD28++(35%)、CD117+(18%)、CD19+(5%)和CD20+(3%)；限制性表達(dá)胞漿輕鏈，其中Kappa輕鏈型占55%，Lambda輕鏈型占45%。所有異常漿細(xì)胞均高表達(dá)CD138++和CD38+，均不表達(dá)胞膜Kappa和胞膜Lambda。見表1。

2.3健康對照組漿細(xì)胞免疫表型健康對照組漿細(xì)胞均表達(dá)CD38++、CD138+、CD19+、CD81+、CD27++和CD45+，不表達(dá)CD117、CD33、CD20、胞膜Kappa和胞膜Lambda；多克隆性表達(dá)胞漿輕鏈Kappa和Lambda。20例正常骨髓中有2例(10%)表達(dá)CD56+，2例(10%)弱表達(dá)CD200dim+，1例(5%)弱表達(dá)CD28dim+。見表1。

表1　正常漿細(xì)胞和異常漿細(xì)胞免疫表型特點

3討論

近年來，隨著對MM認(rèn)識的深入，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓瘤細(xì)胞免疫表型特征成為MM診斷和預(yù)后判斷的重要依據(jù)[2]。流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓瘤細(xì)胞免疫表型時，合理的設(shè)門策略是提高敏感性和可重復(fù)性的關(guān)鍵。根據(jù)2008年歐洲骨髓瘤工作組(EMN)[3]的推薦，為了準(zhǔn)確定量和富集骨髓瘤細(xì)胞，至少要有一個管抗體組合，將CD38、CD138、CD45包括在內(nèi)；初始設(shè)門應(yīng)該包括CD38++和CD138+共表達(dá)。本研究采用CD138/CD45/SSC聯(lián)合設(shè)門，每管均包括CD138和CD45兩種抗體，其中有一管包括CD38、CD138和CD45三種抗體，與EMN的要求一致，分析時首先使用CD38/CD138表達(dá)而不是CD138/CD45設(shè)門，可確保不遺漏CD45+漿細(xì)胞；同時選擇多項細(xì)胞膜表面和胞漿抗原來區(qū)別正常與異常漿細(xì)胞。與國內(nèi)相關(guān)研究比較，本研究具有設(shè)門方案更精確，檢測抗原譜更廣，參數(shù)更多的特點。

本研究對MM患者和正常骨髓進(jìn)行了胞漿Kappa及Lambda的檢測，采用EMN推薦的檢測組合(cykappa/Lambda/CD19/CD38/CD138/CD45)，可以同時分析CD38++CD138+CD19-和CD38++CD138+CD19+兩類細(xì)胞的輕鏈克隆性，提高了檢測的靈敏度。結(jié)果顯示，MM患者異常漿細(xì)胞的胞漿免疫球蛋白輕鏈均存在單克隆限制性表達(dá)，而正常漿細(xì)胞均呈多克隆表達(dá)。異常漿細(xì)胞典型的免疫表型為CD38++、CD138+、CD19-、CD56+、CD117+、CD45dim+/-、CD20+[3]。雖然絕大部分正常漿細(xì)胞表型是CD19+CD56-CD45+，然而可以檢測到少量正常漿細(xì)胞免疫表型與異常漿細(xì)胞相似。國外學(xué)者[4-6]報道正常骨髓中有20%～40%的正常漿細(xì)胞不表達(dá)CD19，10%～47%的正常漿細(xì)胞表達(dá)CD56。在正常獻(xiàn)髓者骨髓中可以檢測到漿細(xì)胞CD45弱表達(dá)(dim)[5]，CD45的表達(dá)隨著漿細(xì)胞分化過程逐漸下降[7-8]。少量正常漿細(xì)胞CD19-CD56+CD45dim+的表達(dá)可能導(dǎo)致異常漿細(xì)胞百分比的錯誤計算[6]。Tembhare等[9]報道CD19、CD56和CD45抗原鑒別正常漿細(xì)胞和異常漿細(xì)胞特異性低，特異性分別為50%、74%、59%；CD20雖然有高的特異性(91%)，但是敏感度只有34%；CD81聯(lián)合以上抗原檢測特異性和敏感度均可以達(dá)到100%。

本研究結(jié)果表明，40例MM患者全部表達(dá)CD38++、 CD138+，有38例(95%)CD45弱陽性表達(dá)或陰性，有28例(70%)CD56陽性表達(dá)，2例(5%)CD19陽性表達(dá)；20例正常組骨髓全部表達(dá)CD19+和CD45+，有2例(10%)表達(dá)CD56+。CD81在正常漿細(xì)胞上全部表達(dá)，但是在異常漿細(xì)胞上弱表達(dá)或陰性，是區(qū)別正常漿細(xì)胞和異常漿細(xì)胞的有效診斷指標(biāo)[10]。本研究顯示40例MM病例有16例CD81弱陽性表達(dá)或陰性，較Tembhare等[9]報道的比值偏低，而健康對照組無一例CD81弱陽性表達(dá)或陰性。CD81是鑒別良惡性漿細(xì)胞的重要標(biāo)志之一，并且可能與MM發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，可以作為骨髓瘤的一種新的惡性預(yù)后指標(biāo)[11]。CD200也是鑒別良惡性漿細(xì)胞的有效診斷指標(biāo)之一，在正常漿細(xì)胞上弱表達(dá)，而在異常漿細(xì)胞上強(qiáng)表達(dá)。本研究顯示MM組有19例(48%)強(qiáng)表達(dá)CD200++，比Aref等[12]報道的比例低，而健康對照組有2例(10%)弱表達(dá)CD200dim+。CD200異常表達(dá)與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，是預(yù)后不好的因素[13-14]。目前國內(nèi)尚無關(guān)于CD81和CD200在MM患者中檢測和應(yīng)用的報道。本研究將CD81和CD200作為MM病例常規(guī)檢查指標(biāo)，提高了診斷率和準(zhǔn)確度。多項研究[15-21]表明，基本的檢測組合包括CD19和CD56可以覆蓋至少90%的MM患者，聯(lián)合CD20、CD117、CD28和CD27抗原可以增加到95%以上的患者。本組40例MM患者骨髓中惡性漿細(xì)胞診斷效率達(dá)到100%。

多項研究表明，CD19+、CD56+、CD117+、CD20+、CD27dim+/-、CD28++、CD33+等抗原表達(dá)異常與MM患者的預(yù)后密切相關(guān)，是預(yù)后不好的因素[3,22-24]。有研究報道CD117抗原表達(dá)與酪氨酸激酶的活化有相關(guān)性，如果患者CD117抗原表達(dá)陽性率高，可以提示臨床采用酪氨酸激酶抑制劑治療[25]。CD20陽性MM患者是否對利妥昔單抗有效，目前報道不一致。有研究[26]報道，療效與患者CD20陽性細(xì)胞的比例有關(guān)。

總之，利用MP-FCM同時檢測胞膜CD38、CD138、CD45、CD19、CD56、CD81、CD200、CD27、CD28、CD117、CD20和CD33多項抗原，及胞膜和胞漿免疫球蛋白輕鏈(kappa/Lambda)的表達(dá)情況,可以區(qū)分良惡性漿細(xì)胞，在MM的診斷與鑒別診斷，預(yù)后判斷，靶向治療等方面有著重要的價值。

(本文圖1見封三)

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基金項目:國家自然科學(xué)基金面上項目(81472018)；安徽省自然科學(xué)基金面上項目(1408085MH145)

作者簡介：張翠萍，主管技師，Email:794609084@qq.com

中圖分類號:R733.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.03.002

(收稿日期：2015-10-08)

Immunophenotype and its clinical significant of multiple myeloma

ZhangCuiping*,WangPeng,LiQing,XuXiucai,HuChaojie,ZhengNan

(*CentralLaboratoryofMedicalResearchCenter,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniverstiy,Hefei230001,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the immunophenotype and its clinical significant of Multiple Myeloma(MM). MethodsThe immunophenotype of 40 patients with MM and 20 normal volunteers were detected by multiparameter flow cytometry(MP-FCM). ResultsThe abnormality expression of antigens sequence of patients with MM was CD45dim+/-(95%),CD81dim+/-(80%),CD56+(70%),CD27dim+/-(50%),CD200++(48%),CD33+(40%),CD28++(35%),CD117+(18%),CD19+(5%),CD20+(3%) in order. However the positive rations of CD56+, CD200dim+and CD28dim+were 10%, 10%and 5%, respectively. ConclusionMP-FCM inspections can accurately discriminate the benign and malignant plasma cell,and provide evidence for prognosis evaluation and targeted therapy.

[Key words]Multiple myeloma ; Immunophenotyping; Plasma Cells ; Flow cytometry