HPLC—DAD法同時(shí)測(cè)定清肺寧嗽丸中4種成分的含量

李憲剛　于遠(yuǎn)洋　董斌　張敬武

[摘要] 目的 建立用HPLC-DAD同時(shí)測(cè)定清肺寧嗽丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷4種成分含量的方法。 方法 采用安捷倫TC-C18（4.6mm×250mm，5μm）為色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～8min，19%A；8～30min，19%A→50%A），流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。 結(jié)果 甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷線性范圍分別0.03208～0.3208μg（r=0.9992），0.03206～0.3206μg（r=0.9992），0.01720～0.1720μg（r=0.9994），0.2991～2.991μg（r=0.9999）；平均加樣回收率（n=6）均在97.2%～101.3%范圍內(nèi)；RSD均小于2.0%。 結(jié)論 本研究建立的方法符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，適用于同時(shí)測(cè)定清肺寧嗽丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷的含量。

[關(guān)鍵詞] 清肺寧嗽丸；HPLC-DAD；甘草苷；柚皮苷；橙皮苷；黃芩苷

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2016）09-36-04

[Abstract] Objective To establish a method for simultaneous determination of liquriritin， naringin， hesperidin and baicalin four ingredients in Qingfei Ningsou Pills by HPLC-DAD. Methods The determination was performed by HPLC on Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5μm） column， The mobile phase consisted of acetonitrile （A）- 0.1% phosphoric acid solution （B） with gradient elution （0-8 min，19%A；8～30 min，19%A→50%A）at a flow rate of 1.0 mL·min-1； The detection wavelength was 280 nm. Results The calibration curves were linear in the range of 0.03208-0.3208μg（r=0.9992） for liquriritin，0.03206-0.3206μg （r=0.9992）for naringin，0.01720-0.1720μg（r=0.9994） for hesperidin，0.2991-2.991μg （r=0.9999）for baicalin. All recoveries （n=6） were within the range of 97.2%-101.3%， RSD values was less than 2.0%. Conclusion The established method of the article is consistent with the method validation requirements and can be used for simultaneous determination of liquriritin， naringin， hesperidin and baicalin in Qingfei Ningsou Pills.

[Key words] Qingfei Ningsou pills； HPLC-DAD； Liquriritin； Naringin； Hesperidin； Baicalin

清肺寧嗽丸由同藥集團(tuán)大同制藥有限公司研制，具有清肺、止咳、化痰功能，用于肺熱咳嗽，痰多粘稠。該中藥復(fù)方制劑由黃芩、枳殼、甘草、橘紅等十三味中藥材粉碎，過(guò)篩，混勻而制成。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第五冊(cè)[1]，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3-B-1028-91，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)含量測(cè)定檢驗(yàn)項(xiàng)目。由于其成分復(fù)雜，為實(shí)現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，建立準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的分析方法至關(guān)重要。本研究查閱相關(guān)文獻(xiàn)，建立HPLC-DAD梯度洗脫法在同一色譜條件下對(duì)中4種活性成分（甘草苷[2-3]、柚皮苷、橙皮苷[4-6]、黃芩苷[7-8]）同時(shí)測(cè)定的檢測(cè)方法，采用該方法可有效地對(duì)清肺寧嗽丸的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，為更全面有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters e2695高效液相色譜儀，配備waters2998二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、電子天平Sartorius BP211D②。甲醇、乙腈為色譜純，硅藻土為化學(xué)純（上海市奉賢奉城試劑廠），水為超純水。

對(duì)照品甘草苷（批號(hào)：111610-201106）、柚皮苷（批號(hào)：110722-201312）、橙皮苷（批號(hào)：110721-201316）、黃芩苷（批號(hào)：110715-201318）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。清肺寧嗽丸，（同藥集團(tuán)大同制藥有限公司，Z14020286），為大蜜丸，每丸重9g。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 取甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇溶液溶解并稀釋成含甘草苷0.1604mg/mL、柚皮苷0.1603mg/mL、橙皮苷0.0860mg/mL、黃芩苷1.4957mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取上述溶液5mL，置50mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取供試品3丸，剪碎，混勻，取適量，精密稱定，精密加入半量的硅藻土，研勻，取2.0g，精密稱定，加入70%乙醇100mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再次稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減重，過(guò)濾，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按清肺寧嗽丸的制備工藝，分別制成不含黃芩、枳殼、甘草和橘紅的陰性樣品。按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：安捷倫TC-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8min，19%A；8～30min，19%A→50%A）；流速1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。4種成分分離度均大于2.0。理論板數(shù)以4個(gè)目標(biāo)成分計(jì)均不低于5000。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，按“2.2”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果陰性樣品的色譜圖中，在與對(duì)照品色譜圖相同的保留時(shí)間位置上未見(jiàn)色譜峰，說(shuō)明陰性無(wú)干擾，該法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察

取混合對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣2，5，10，15，20μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷的進(jìn)樣量分別在0.03208～0.3208 μg， 0.03206～0.3206μg，0.01720～0.1720μg，0.2991～2.991μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，以對(duì)照品的濃度X為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷回歸方程分別為：Y=2.1778×106X-11889，r=0.9992；Y=2.1749×106X+2522.4，r=0.9992；Y=2.3814×106X-2696.1，r=0.9994；Y=3.6839×106X-35878，r=0.9999。

2.5 精密度試驗(yàn)

取一份混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.45%，0.21%，0.57%，0.91%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)清肺寧嗽丸樣品5丸，剪碎，混勻，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按上述“2.2”色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，結(jié)果樣品中的甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷含量RSD分別為1.6%，1.5%，1.9%，1.0%。表明其重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，在0，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣10μL，結(jié)果甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.48%，0.96%，0.49%，0.62%。表明供試品溶液在室溫放置24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品（批號(hào)20150601）6份各1.0 g，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備溶液10mL，加入70%乙醇90mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10μL，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1～4。

2.9 樣品測(cè)定

取清肺寧嗽丸3批（為對(duì)企業(yè)質(zhì)量數(shù)據(jù)保密，產(chǎn)品批號(hào)以代碼標(biāo)識(shí)），按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10μL，進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 提取溶劑和方法的選擇

為能兼顧甘草苷[9]、柚皮苷[10-11]、橙皮苷[12]、黃芩苷[13]的提取溶劑和方法[14]的要求，并參考中國(guó)藥典[15]制備方法，本試驗(yàn)對(duì)不同提取溶劑（甲醇、乙醇）進(jìn)行考察，結(jié)果表明四種被測(cè)組分在乙醇中提取效率較高，于是進(jìn)一步考察了用不同濃度的乙醇溶液提取對(duì)樣品含量的影響，試驗(yàn)對(duì)同一批樣品，分別考察了用乙醇、70%乙醇、50%乙醇提取的樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三種提取溶劑中以70%乙醇提取的樣品中黃芩苷和柚皮苷的含量最高；試驗(yàn)比較了超聲提取和加熱回流提取的方法，結(jié)果表明加熱回流提取方法提取效率較高，并對(duì)提取時(shí)間（30、60、120min）進(jìn)行考察，最終選用70%乙醇溶液加熱回流60min作為供試品溶液的提取制備方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)被測(cè)組分在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行DAD檢測(cè)，甘草苷在277nm處有最大吸收；柚皮苷在283nm處有最大吸收；橙皮苷在283nm處有最大吸收；黃芩苷在280nm處有最大吸收。兼顧4種活性成分紫外最大吸收波長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)研究確定280nm為本實(shí)驗(yàn)的吸收波長(zhǎng)。方法學(xué)考察結(jié)果表明該波長(zhǎng)下實(shí)驗(yàn)方法精密、穩(wěn)定、準(zhǔn)確。

3.3 流動(dòng)相的選擇

比較乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行等度及梯度洗脫，綜合考慮分離效果、峰型、分析時(shí)間等因素，最后確定乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫作為流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.4 小結(jié)

清肺寧嗽丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)黃芩等藥材進(jìn)行顯微和薄層鑒別，不能全面反映該制劑的質(zhì)量，本研究所建立的檢驗(yàn)方法可對(duì)清肺寧嗽丸處方中4個(gè)活性成分進(jìn)行定量分析，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為有效控制中藥復(fù)方制劑質(zhì)量并進(jìn)一步提升質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了研究數(shù)據(jù)和參考方法[16]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 原衛(wèi)生部. 衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第五冊(cè)）[S]. 1992：166.

[2] 文謹(jǐn)， 劉起華，王菲. HPLC同時(shí)測(cè)定參柏顆粒中甘草苷、柚皮苷、鹽酸小檗堿[J]. 中草藥， 2011（10）：2005-2007.

[3] 傅勇，李旭，虞金寶. HPLC同時(shí)測(cè)定紅花逍遙片中芍藥苷及甘草苷含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2012， 18（24）：152-154.

[4] 宋劍鋒，馮敬騫，胡建華，等. HPLC法同時(shí)測(cè)定常山胡柚花中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的量[J]. 中草藥，2014， 45（6）：854-856.

[5] 康四和，周銳，聶晶. HPLC測(cè)定小兒消積止咳口服液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量[J]. 中成藥，2010， 32（12）：2088-2091.

[6] 趙奎君，鄭玉忠，董婷霞，等.不同產(chǎn)地枳殼藥材HPLC指紋圖譜及其柚皮苷、新橙皮苷和辛弗林含量分析[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志， 2011（12）：955-959.

[7] 滕宇，盧靜華. RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定地榆槐角丸中芍藥苷、橙皮苷和黃芩苷[J]. 中成藥， 2013（9）：1929-1932

[8] 張婷，美爾哈巴·熱西提，林瀟，等.HPLC-MS/MS法測(cè)定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷[J]. 中草藥，2012（4）：711-713

[9] 趙鐳，師清芝，唐星，等.甘草中甘草酸和甘草苷的提取純化工藝研究[J]. 中國(guó)藥房，2009，20（6） ： 426-429.

[10] 周石磊，王鴻飛，杜潔雄.柚皮中柚皮苷乙醇提取工藝研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)， 2006， 22（7）：184-187.

[11] 劉學(xué)仁.柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的提取與分析研究[D]. 黃石：湖北師范學(xué)院， 2011：27-29.

[12] 牛輝，于宏偉，韓明會(huì)，等.醇溶劑提取橙皮苷進(jìn)展研究[J]. 河北化工，2010，33（8）：7-8.

[13] 蔣巍，田艷，劉艷杰. 注射用黃芩甙提取工藝研究[J]. 廣東化工，2014（18）：42-43

[14] 呂陽(yáng)成，駱廣生，戴猷元.中藥提取工藝研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2001（5）：232-235.

[15] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典一部[S]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：491.

[16] 王銳，陸鋮，葛斌，等. HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定消乳增膠囊的三種活性成分[J].西部中醫(yī)藥，2015，28（3）：25-28.

（收稿日期：2016-01-21）