姜黃素聯合吉西他濱對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡的影響

陜西省腫瘤醫院內一科(西安 710061)

李　旭　安改麗△　王玉珍　李　楠▲

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姜黃素聯合吉西他濱對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡的影響

陜西省腫瘤醫院內一科(西安 710061)

李旭安改麗△王玉珍李楠▲

摘要目的：觀察姜黃素、吉西他濱單藥及聯合用藥對肝癌細胞HepG2增殖和凋亡的影響。方法：使用不同濃度的姜黃素、吉西他濱以及兩藥聯合分別作用肝癌細胞HepG2 24h、48h、72h。MTT法檢測上述藥物單用或聯用對HepG2細胞的生長抑制作用；采用流式細胞儀檢測其對HepG2細胞凋亡率的影響。結果：姜黃素、吉西他濱單藥及聯合用藥對HepG2細胞有明顯的生長抑制作用，存在時間劑量依賴關系，均可誘導HepG2細胞凋亡，聯合用藥有協同作用。結論：姜黃素、吉西他濱能夠抑制HepG2細胞增殖，誘導細胞凋亡，兩藥聯用有協同作用。

主題詞肝腫瘤，實驗性細胞增植細胞凋亡姜黃素/藥理學@吉西他濱

惡性腫瘤是影響人類健康的最嚴重疾病之一，每年有近千萬人死于惡性腫瘤[1]。肝癌是全球常見且惡性程度很高的腫瘤, 也是我國最常見的惡性腫瘤之一，具有發病率高、病死率高、生存期短等特點[2]。早期肝癌可考慮手術治療，但因其起病隱匿，早期癥狀不典型，發現時多已是晚期，無手術機會，治療以藥物治療為主，且療效不佳[3]。祖國醫學博大精深，中醫中藥在腫瘤治療中有毒副作用相對較小、安全性高等特點。中醫及中西醫結合的方法在肝癌治療中也越來越受到重視。姜黃素作為中藥姜黃主要活性提取物, 有類非甾體類抗炎藥(NSAIDs)的作用特點[4]。近年來其抗腫瘤作用被醫學專家廣泛關注。研究發現姜黃素對包括膀胱癌、乳腺癌、肝癌等在內的多種腫瘤細胞有增殖抑制作用[5-6]。姜黃素誘導細胞凋亡是其抗腫瘤作用的重要機制，涉及一系列復雜的生物學過程，并受細胞內外多種途徑及信號分子調控，不同的途徑所表現形式不同，它們之間有交叉，有重疊，構成了錯綜復雜的調控網絡。本研究主要探討姜黃素、吉西他濱單用及聯合用藥對人肝癌細胞HepG2體外增殖及凋亡的影響，為臨床中西醫結合治療肝癌提供一定實驗依據。

材料與方法

1材料與儀器肝癌細胞株HepG2(西安交通大學醫學院醫學中心實驗室惠贈)；RPMI 1640培養基(美國GIBCO公司)；噻唑蘭(MTT)(美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；Annexin-V/PI雙染凋亡試劑盒(深圳晶美生物公司)；細胞培養箱( 美國Thermo 公司)；Genios 多功能酶標儀( 美國TECAN 公司)；倒置顯微鏡( DXM1200) 為日本Nikon 公司產品; 流式細胞儀為美國BD Calibur 產品。

2方法

2.1細胞培養：采用含10%小牛血清的RMPI-1640培養基培養肝癌細胞HepG2，培養于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中，其貼壁生長至70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2細胞增殖檢測：取對數生長期的肝癌細胞HepG2以約1×104/ml密度接種于96孔板上，分別加入不同濃度的姜黃素(2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40mmol/L)、吉西他濱(2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L)和兩藥聯合(姜黃素10 mmol/L+吉西他濱10 mmol/L)進行干預，每組5個復孔。以含相同濃度DMSO的培養液為對照，分別于培養24h、48h、72h后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 ml，繼續孵育4 h，終止培養，吸去孔內上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，充分溶解結晶物。用多功能微板測試系統于490 nm處測定OD值。每組實驗重復3次。抑制率(%)=(1-試驗孔平均OD 值/對照孔平均OD值)×100%

2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡：取對數生長期的HepG2細胞消化后2 ml/孔接種至6孔板內，細胞濃度控制在1×106個/ml，分別加入濃度為10mmol/L 的CUR、GEM、CUR+GEM處理組藥物分別處理HepG2細胞48h 后，收集各處理組HepG2細胞, 用PBS 洗滌二次收集細胞, 加入500μl Binding Buffer和FITC標記的Annexin V(20mg/ml)10ml，室溫避光30min，再加入PI(50 mg/ml)5ml，避光反應5min后，立即用FACS進行流式細胞儀定量檢測(一般不超過1h)，同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為對照。進行流式細胞儀的觀察和檢測。本實驗重復3次。

3統計學方法運用SPSS18.0統計學軟件，組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗標準。

結果

1姜黃素對HepG2細胞增殖的影響分別用不同濃度姜黃素處理肝癌細胞HepG2 24h、48h、72h后得到濃度-抑制率曲線圖(圖1)：可見姜黃素對肝癌細胞HepG2增殖具有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增大，抑制率明顯增高；48h和72h的抑制率明顯高于24h，呈時間與劑量依賴性。

2吉西他濱對HepG2細胞增殖的影響分別用不同濃度吉西他濱處理肝癌細胞HepG2 24h、48h、72h后得到濃度-抑制率曲線圖(如圖2)：可見吉西他濱對肝癌細胞HepG2增殖具有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增大，抑制率明顯增高；48h和72h的抑制率明顯高于24h，即呈時間與劑量依賴性。

3姜黃素聯合吉西他濱對HepG2細胞增殖的的影響姜黃素、吉西他濱和姜黃素聯合吉西他濱對HepG2細胞的增殖抑制作用(圖3)：可見姜黃素、吉西他濱及二藥聯合組對HepG2肝癌細胞都具有明顯的生長抑制作用，聯合用藥組的抑制率明顯高于單藥組。

圖1　不同濃度姜黃素對肝癌細胞的濃度-抑制率曲線

圖2　不同濃度吉西他濱對肝癌細胞的濃度-抑制率曲線

圖3　不同實驗組對細胞的時間-抑制率曲線

4不同實驗組對肝癌HepG2細胞凋亡的影響用流式細胞儀檢測HepG2細胞在不同作用條件下48h后的凋亡率。結果(圖4)：可見對照組與用藥組比較, HepG2 細胞的凋亡率較低, 差異有統計學意義(P<0.05)。姜黃素、吉西他濱單藥組與聯合用藥組比較, HepG2細胞的凋亡率較低, 差異有統計學意義(P<0.05)。說明姜黃素可誘導肝癌HepG2細胞凋亡，誘導凋亡作用不及吉西他濱，但作為天然藥物，通過聯合用藥可增加其誘導肝癌細胞凋亡的的作用。

圖4　不同實驗組作用于肝癌HepG2細胞48h后的凋亡圖及凋亡率比較(與CON組相比,*P<0.05；與CUR組相比,# P<0.05；與GEM組相比,ΦP<0.05)

討論

腫瘤細胞是體內具有無限增殖能力的細胞，腫瘤的發生不僅與細胞增殖有關，也與細胞凋亡失衡有關。抑制腫瘤細胞的增殖、促進凋亡是目前抗腫瘤治療的熱點。中藥及其提取物的抗腫瘤作用已經得到醫學專家的的廣泛認可，開展其抗癌機制研究，具有重要的現實意義和理論價值。姜黃素作為從姜科植物黃姜根莖中提取的黃色酸性多酚類物質，不僅具有降脂、抗炎、抗氧化、抗病毒和預防突變等多種藥理活性，也具有明顯的抗腫瘤活性[8],且具安全性高、不良反應小等特點。目前,研究者普遍認為姜黃素抗腫瘤機制可能主要與抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡有關，通過調控線粒體凋亡通路及死亡受體通路在內的多條信號傳導通路，引起腫瘤細胞凋亡；其抗腫瘤療效確切，通過多個環節作為作用靶點起到抗腫瘤作用。他們各種途徑之間存在著直接或間接的聯系，單獨或協同發揮抗腫瘤作用。王威等[9]研究現實，通過MTT法檢測姜黃素對肝癌細胞有明顯的生長抑制作用，隨著劑量增加，其效應也相應增加，電鏡結果顯示經姜黃素作用后癌細胞超微結構發生改變，凋亡多見。胡慶華[10]等研究顯示，姜黃素對宮頸癌HeLa有明顯的抑制作用，作用機制可能通過內質網應激途徑誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡有關。趙琳琳[11]等研究顯示，姜黃素對肝癌細胞有明顯的增殖抑制作用，并能誘導肝癌細胞凋亡，其作用機制可能與下調Wnt /β-catenin信號通路有關。邱偉等[12]研究發現，姜黃素不僅抑制肝癌HepG2細胞的增殖，并且可以通過下調COX-2及侵襲相關分子MMP-2及MMP-9的表達來抑制腫瘤細胞的侵襲能力。研究發現姜黃素對多種腫瘤有顯著的抑制作用。姜黃素在發揮抗腫瘤治療效果的同時，對正常細胞并無明顯毒副作用，應用于人類十分安全，因而具有良好的臨床應用潛力。

我們的實驗通過MTT法檢測姜黃素、吉西他濱單藥及聯合用藥干預肝癌HepG2細胞的抑制率，結果顯示單用及聯合用藥都對HepG2細胞有明顯的生長抑制作用，且存在時間-劑量等效應關系。采用 AnnexinV/FITC雙染色法檢測細胞凋亡，結果顯示姜黃素、吉西他濱可以誘導肝癌HepG2細胞凋亡，聯合時作用更為明顯，存在協同作用。姜黃素對肝癌HepG2細胞有明顯的生長抑制作用，其作用機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡有關，然而姜黃素對肝癌HepG2細胞具體的抗癌機制有待進一步研究。

參考文獻

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[2] Chuang S C, La Vecchia C, Boffetta P. Liver cancer: Descriptive epidemiology and risk factors other than HBV and HCV infection[J]. Cancer Letters,2009,286(1):9-14.

[3] Robinson AIGA. Hepatocellular carcinoma: Epidemiology, risk factors and pathogenesis[J]. World Journal of Gastroenterology,2008,14(27):4300-4308.

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[8] Goel A, Kunnumakkara AB, Aggarwal BB. Curcumin as “Curecumin”From kitchen to clinic[J]. Biochemical Pharmacol, 2008,75(4):787-809.

[9]王威,賀紅光,范麗,等.姜黃素對人肝癌細胞株HepG-2 生長及超微結構的影響[J].華中科技大學學報(醫學版), 2005,34(3):323-325.

[10] 胡慶華,賀建文,趙小軍. 姜黃素通過內質網應激途徑誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡的實驗研究[J]. 陜西醫學雜志,2013,10:1279-1281,1325.

[11]趙琳琳,陳劍群,徐學軍. 姜黃素對肝癌細胞Bel7402、QGY7703增殖凋亡及Wnt/β-catenin信號通路的影響[J]. 中華臨床醫師雜志(電子版),2013,11:4902-4906.

[12] 邱偉,劉陽,曹衛,等.姜黃素抑制肝癌細胞系HepG2的增殖、侵襲及其機制[J].現代腫瘤醫學, 2015,23(22):3221-3225.

(收稿:2016-01-08)

通訊作者：▲西安市兒童醫院

【中圖分類號】R392.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.05

Effects of curcumin combined with gemcitabine on the proliferation and apoptosis of hepatocarcinoma cells HepG2 in vitro

Department of First Internal Medicine, Shaanxi Province Tumor Hospital(Xi’an 710061)

Li XuAn Gaili Wang Yuzhenet al

ABSTRACTObjective：To study the effect of curcumin (CUR), gemcitabine(GEM)and their synergergistic(CUR+GEM) effect on proliferation and apoptosis of Hepatocarcinoma cells HepG2. Methods:HepG2 was treated with CUR,GEM and CUR+GEM at different concentration and different time,HepG2 cells were tested for proliferation activity by MTT assay, and analyzed for apoptosis rate by flow cytometry. Results:CUR, GEM and CUR+GEM produced time-and dose-dependent inhibition of HepG2cells. CUR+GEM showed a higher apoptosis rate induction than CUR or GEM alone (P <0.05). Conclusion: CUR and GEM both have the effect of inhibition on the proliferation and induction of apoptosis in Hepatocarcinoma cells HepG2. Combining application can enhance apoptosis.

KEY WORDSLiver neoplasms,ExperimentalCell proliferationApoptosisCurcumin/pharmacology@Gemcitabine

△ 陜西省人民醫院