植物Tetraspanins蛋白的研究進展

趙倩倩, 王雨欣

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

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植物Tetraspanins蛋白的研究進展

趙倩倩, 王雨欣

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

摘要Tetraspanins(TETs)是一大類進化性保守的、具有4次跨膜結構域的蛋白超家族，廣泛分布于所有多細胞生物體中。對植物TETs蛋白的結構特征、系統進化，以及模式植物擬南芥的TETs蛋白超家族(AtTET1～17)和番茄Tetraspanin3蛋白的生物功能進行綜述，旨在為今后更好地研究植物TETs蛋白超家族提供參考。

關鍵詞Tetraspanins；4次跨膜結構域；AtTET1～17；Tetraspanin 3

自1990年Oren等[1]發現TAPA-1(the target of an antiproliferative antibody)以來，到1997年為止，期間發現近20個基因，均編碼細胞表面蛋白。其基本結構單元均包含4個疏水的跨模區(transmenbrane domains，TM1～TM4)，形成一小、一大2個細胞外環(extracelluar loop，EC1和EC2)，一個小的細胞內環( intracellular loop，ICL)，以及短的N-末端和C-末端尾部。由此，一個新的基因家族誕生，曾被命名為“四次跨膜超家族”(transmembrane 4，TM4或TM4SF或4TM)，或“Tetraspanins超家族”。后被Maecker等[2]提議統一命名“Tetraspanins超家族”。

對TETs超家族的研究，最早起源于動物醫學。研究發現，TETs蛋白位于細胞表面或細胞內的膜上，在物種間高度保守，在真核生物中是多樣化的；它們在動物中的功能和作用機制也被研究地相當深入：已經證實其在精卵融合[3]、光感受器運行[4]、血管發育[5]、動物免疫應答[6]等方面起重要作用[3]；一些研究理論也在醫學上被用于嘗試某些病毒引起的疾病防治，如人乳頭癌病毒[7]等。在植物中對TETs蛋白的研究很少，目前已報道的植物TETs基因也不多。筆者對植物TETs蛋白的結構特征、系統進化，以及幾個已報道的TETs基因的研究情況進行綜述，旨在為今后更好地研究植物TETs蛋白超家族的生物功能及其應用提供借鑒。

1Tetraspanins的結構

TETs是一類從膜上突出3～5 nm的整合蛋白[8]，類似于多細胞動物TETs的核心構造。Boavida等[9]發現植物的TETs蛋白(圖1)也包含4個跨膜區(TM1～TM4)：一個小的細胞外環(EC1)，一個大的細胞外環(EC2)，一個極小的細胞內環(ICL)，一個N-末端和一個C-末端。

圖1　動物(a)和植物(b)中Tetraspanins的拓撲結構示意[9]Fig.1　Schematic diagram of Tetraspanins topological structures in animal(a)and plant(b)

1.1跨膜區(TM1～TM4)跨膜區占TETs本身的50%，是整個分子中最保守的部分。在所有的TETs蛋白中，位于TM1、3和4部分的氨基酸殘基(Asn、Gln和Glu)是高度極性化的，且這些氨基酸殘基70%～90%是保守的[10]，它們能夠在彼此間或與其他氨基酸殘基間形成強烈的氫鍵，從而穩定跨膜區的三級結構[11]。

1.2胞外區(EC1和EC2)與跨膜區和胞內區相比，胞外區更多地表現出序列趨異。如在人類和斑馬魚的TETs中，EC1和EC2僅顯示43%～58%的一致性，而跨膜區和胞內區顯示出高達72%～83%的一致性[10]。

1.2.1小細胞外環(EC1)。目前，對于EC1的了解較少。植物TETs蛋白在EC1包含一個保守性的Cys殘基，而動物TETs的EC1卻沒有；暗示此Cys殘基能夠交聯到EC2上的Cys殘基上。此外，Masciopinto等[12]研究發現，在動物TETs蛋白成員CD81中，EC1是EC2的表面最佳表達所必需的，EC1也許可以協助折疊形成EC2[13]。

1.2.2大細胞外環(EC2)。EC2一直受到更多的關注，被研究的也比較清楚。研究推測，植物TETs蛋白的EC2也由2個亞域構成：保守性亞域和可變性亞域(圖1黃色和藍色底紋部分)。保守性亞域在近膜側，包含3個螺旋(螺旋A、B和E)；可變性亞域連續地插入保守性亞域，位于保守性亞域的頂端，在大小、二級結構和折疊方式上極其多變。這2個亞域的相對拓撲學結構，取決于核心二硫橋的出現和TETs蛋白的獨特亞型數量[14]。但植物TETs的EC2包含9個Cys殘基，可能形成更加復雜的二硫橋，而不是動物TETs典型的4～6個Cys殘基；植物EC2的可變性亞域包含一個保守性的植物專一性“GCCK/RP”模域，在位置和序列上不同于動物TETs蛋白的“CCG”模域。

1.3胞內區(ICL，N-末端和C-末端)除EC2的可變性區域外，N-末端和C-末端是TETs蛋白中的2個可變區；但近膜側的某些Cys殘基是相對保守的、潛在的棕櫚酰化位點(圖1紅色波浪線部分)，這有助于TETs和其互作物間的作用。已經證實，在動物的TETs蛋白中，C-末端在細胞粘著[15]、膜融合[16]和溶酶體靶定位[17]過程中起重要作用[12]。截至目前，對ICL的研究較少。在ICL上，也存在棕櫚酰化位點，可能有助于TETs和其伴侶蛋白(tetraspanin-partner)間的互作[18]。

2系統進化分析

研究表明，從原生動物到多細胞動物，從真菌(酵母除外)到植物和哺乳動物，TETs蛋白均存在；它們廣泛存在于幾乎所有的生物體內，表明TETs經歷了漫長的進化歷程。

目前，TETs蛋白超家族在哺乳動物中有33個成員，在果蠅中有37個成員，在秀麗隱桿線蟲中有20個成員，在真菌中有3個成員和一個類似于TETs家族的成員[19]。因為酵母體內不存在TETs，在其基因組內，即使是遠親的同源物也未被找到一個[20]，因此，TETs最初被認為僅存在于多細胞生物體內。

隨后在原生動物變形蟲Entamoebahistolytica體內鑒定出TETs蛋白，且發現在單細胞生物體變形蟲D.discoideum中，TspanE蛋白包含多細胞動物典型的“CCG”模域；而其他4個Tspans卻表現出一個修飾的“CCK/Y/C”模域，這類似于一些陸生植物突變體中的模域結構[21]。這表明TETs可能在單細胞到多細胞的過渡中行使功能。

另外，苔蘚P.patens和石松門S.moellendorffii的TETs蛋白，也存在植物專一性的“GCCK/RP”模域，暗示“GCCK/RP”模域早在陸生植物世系之前即出現。原因可能是一個新的世系分支出現[21]，或者陸生植物世系趨異分支出來前的一個遺傳模域的修飾或者重組。

3植物Tetraspanins蛋白的功能

目前，對植物中TETs的研究遠落后于動物。為了調查植物基因組是否編碼TETs蛋白，Wang等[22]利用PLAZA對比基因組學平臺的方法探究了11個植物物種，共發現155個TETs基因，并以此構建了一個系統進化樹。依據擬南芥(Arabidopsisthaliana)的TETs基因，該進化樹分為七大組。類似于二穗短柄草、水稻、高粱以及玉米的大多數TETs基因序列處于同一組，大豆和苜蓿也處于同一組，反映了它們的親密關系。

研究還發現，擬南芥編碼17個TETRASPANIN(AtTET1～17)基因，其中大多數的功能未知，唯一進行功能性描述的TETs成員是AtTET1基因；番茄tetraspanin3基因的功能也被報道。

3.1擬南芥AtTET1基因2000年，Cnops等[23]在研究TORNADO1(TRN1)基因時，利用EMS誘變擬南芥Col種子，獲得了tornado2(trn2)突變體，描述了其總體形態表型，發現TRN1蛋白和TRN2蛋白均在初生根表皮模式建立中起重要作用，可能在同一形態建成調控途徑中起作用。2003年，Olmos等[24]篩選擬南芥T-DNA插入突變體獲得了ekeko突變體，鑒定、描述了EKEKO基因(At5g46700人)的結構和功能，發現該基因是植物正常發育所必需的。2004年，Peters等[25]克隆到TRN2基因，和Olmos等[24]鑒定的At5g46700一致。2006年，Cnops等[26]研究發現，TRN2蛋白包含269個氨基酸，可能是一個分泌蛋白，并由4個跨膜區域(TM1～TM4)，2個胞外環(EC1和EC2)，和胞質N-末端及C-末端。由此推測，TRN2蛋白是擬南芥TETs家族的成員，即擬南芥的TETRASPANIN1(TET1)蛋白，TRN2/EKEKO/TET1和TRN1基因(編碼一個富亮氨酸重復蛋白)均在葉片和根的早期發育中起重要作用。2007年，Chiu等[27]對擬南芥的TRN2/TET1基因缺失突變體的研究發現，TRN2/TET1基因能夠影響擬南芥頂端分生組織周邊區的細胞分裂。2011年，Lieber等[28]在研究高等植物大孢子形成的遺傳途徑中，發現TET1/EKEKO/TTRN2和WINDHOSE1(WIH1)及WIH2基因(編碼一類植物和真菌中存在，動物中卻沒有的小多肽)共同作用可以促進大孢子產生。

3.2擬南芥tetraspanins超家族的其他AtTETs基因除TRN2/EKEKO/TET1外，擬南芥基因組中還有16個TETs成員(TET2～TET17)，但其功能尚不明確。Boavida等[9]研究擬南芥的TETs家族發現，大部分的TETs基因有一個內含子(約1 kb)和一個保守的內含子/外顯子連接；TET2、TET5和TET6在編碼序列的5′或3′側多一個小的內含子，而TET10卻含有10個內含子。亞細胞定位試驗表明，除TET15(由于幾個氨基酸殘基組成的一個延伸導致其產生一個較長的胞質N-末端)外，擬南芥的其他TETs成員優先定位于質膜上。其中，TET14、TET15和TET17潛在定位于內質網上；而TET3已經明確定位在質膜上，是一個胞間連絲相關蛋白[29]。表達分析試驗表明，擬南芥的TETs成員在生殖細胞或生殖組織區域呈現出獨特卻重疊的表達模式，這表明擬南芥的TETs成員可能存在基因冗余。

當擬南芥的TETs成員在酵母中表達時，它們之間能夠形成同二聚體和異二聚體。這也表明擬南芥TETs家族存在功能冗余，且可能源自于TET-TET互作的多樣性。

3.3番茄tetraspanin3基因Tetraspanin 3 蛋白是番茄TETs蛋白超家族的一員，裴延飛等[30]研究發現，番茄的tetraspanin3 基因與葡萄的同源基因在一個獨立的進化分支上；其在番茄的各器官中均有表達；當正常番茄植株感染黃化曲葉病毒(TYLCV)后，tetraspanin3基因表達量上調；當敲除番茄植株的tetraspanin3基因后，葉片出現扭曲，且在接種TYLCV 后，被感染的TYLCV 病毒量降低50%以上。這表明Tetraspanin 3 蛋白與番茄葉片的生長發育有關，并對TYLCV 侵染番茄植株起正調控作用。

4展望

由于特異的病毒感染需要特別的TETs以被識別并進入細胞，一些哺乳動物的Tetraspanins蛋白成為藥物作用的靶點，為預防或治療相應疾病提供了新途徑。而TETs 蛋白的高度保守性研究表明，TETs基因家族具有相似或相近的功能[31]，因此，從理論上講，植物的TETs 蛋白超家族在植物發育過程中有許多重要的作用。然而，目前對植物中TETs基因家族的研究相對較少，其作用機制和生化途徑更是鮮有報道。該研究對植物TETs 蛋白超家族的研究情況進行了綜述，以期為植物TETs 蛋白的深入研究和將來的實際生產應用提供參考。

參考文獻

[1] OREN R，TAKAHASHI S，DOSS C，et al.TAPA-1，the target of an antiproliferative antibody，defines a new family of transmembrane proteins[J].Mol Cell Biol，1990，10(8)：4007-4015.

[2] MAECKER H T，TODD S C，LEVY S.The tetraspanin superfamily：Molecular facilitators[J].FASEB J，1997，11(6)：428-442.

[4] CONLEY S M，STUCK M W，NAASH M I.Structural and functional relationships between photoreceptor tetraspanins and other superfamily members[J].Cell Mol Life Sci，2012，69(7)：1035-1047.

[5] BAILEY R L，HERBERT J M，KHAN K，et al.The emerging role of tetraspanin microdomains on endothelial cells[J].Biochem Soc Trans，2011，39(6)：1667-1673.

[6] RUBINSTEIN E.The complexity of tetraspanins[J].Biochem Soc Trans，2011，39(2)：501-505.

[7] RICHARDS K F，MUKHERJEE S，BIENKOWSKA-HABA M，et al.Human papillomavirus species-specific interaction with the basement membrane-resident non-heparan sulfate receptor[J].Viruses，2014，6：4856-4879.

[8] CHARRIN S，JOUANNET S，BOUCHEIX C.Tetraspanins at a glance[J].Journal of cell science，2014，127(Pt17)：3641-3648.

[9] BOAVIDA L C，QIN P，BROZ M，et al.Arabidopsistetraspanins are confined to discrete expression domains and cell types in reproductive tissues and form homo-and heterodimers when expressed in yeast[J].Plant physiology，2013，163(2)：696-712.

[10] STIPP C S，KOLESNIKOVA T V，HEMLER M E.Functional domains in tetraspanin proteins[J].Trends Biochem Sci，2003，28(2)：106-112.

[11] SENES A，UBARRETXENA-BELANDIA I，ENGELMAN D M.The Cα-H…O hydrogen bond：A determinant of stability and specificity in transmembrane helix interactions[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(16)：9056-9061.

[12] MASCIOPINTO F，CAMPAGNOLI S，ABRIGNANI S，et al.The small extracellular loop of CD81 is necessary for optimal surface expression of the large loop，a putative HCV receptor[J].Virus Res，2001，80(1/2)：1-10.

[13] RAJESH S，SRIDHAR P，TEWS B A，et al.Structural basis of ligand interactions of the large extracellular domain of tetraspanin CD81[J].Journal of virology，2012，86(18)：9606-9616.

[14] MICHEL S，ALIX D，CECILE L G，et al.Structure of the tetraspanin main extracellular domain[J].J Biol Chem，2001，276(43)：40055-40064.

[15] WANG H X，KOLESNIKOVA T V，DENISON C，et al.The C-terminal tail of tetraspanin protein CD9 contributes to its function and molecular organization[J].J Cell Sci，2011，124(16)：2702-2710.

[16] EDRINGTON T C，YEAGLE P L，GRETZULA C L，et al.Calcium-dependent association of calmodulin with the C-terminal domain of the tetraspanin protein peripherin/rds[J].Biochemistry，2007，46(12)：3862-3871.

[17] TAKINO T，MIYAMORI H，KAWAGUCHI N，et al，Tetraspanin CD63 promotes targeting and lysosomal proteolysis of membrane-type 1 matrix metalloproteinase [J].Biochem Biophys Res Commun，2003，304(1)：160-166.

[18] MAZUROV D，HEIDECKER G，DERSE D.The inner loop of tetraspanins CD82 and CD81 mediates interactions with human T cell lymphotrophic virus type 1 Gag Protein[J].J Biol Chem，2007，282(6)：3896-3903.

[19] HUANG S，YUAN S，DONG M，et al.The phylogenetic analysis of tetraspanins projects the evolution of cell-cell interactions from unicellular to multicellular organisms [J].Genomics，2005，86(6)：674-684.

[20] GARCIA-ESPA A A，CHUNG P J，SARKAR I N，et al.Appearance of new tetraspanin genes during vertebrate evolution[J].Genomics，2008，91(4)：326-334.

[21] DESALLE R，MARES R，GARCIA-ESPAA A.Evolution of cysteine patterns in the large extracellular loop of tetraspanins from animals，fungi，plants and single-celled eukaryotes[J].Mol Phylogenet Evol，2010，56(1)：486-491.

[22] WANG F，VANDEPOELE K，VAN LIJSEBETTENS M.Tetraspanin genes in plants[J].Plant Sci，2012，190：9-15.

[23] CNOPS G，WANG X，LINSTEAD P，et al.Tornado1 and Tornado2 are required for the specification of radial and circumferential pattern in theArabidopsisroot[J].Development，2000，127(15)：3385-3394.

[24] OLMOS E，REISS B，DEKKER K.The ekeko mutant demonstrates a role for tetraspanin -like protein in plant development[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，310(4)：1054-1061.

[25] PETERS J L，CNOPS G，NEYT P，et al.An AFLP-based genome-wide mapping strategy[J].Theor Appl Genet，2004，108(2)：321-327.

[26] CNOPS G，NEYT P，RAES J，et al.The TORNADO1 and TORNADO2 genes function in several patterning processes during early leaf development inArabidopsisthaliana[J].Plant cell，2006，18(4)：852-866.

[27] CHIU W H，CHANDLER J，CNOPS G，et al.Mutations in theTORNADO2 gene affect cellular decisions in the peripheral zone of the shoot apical meristem ofArabidopsisthaliana[J].Plant Mol Biol，2007，63(6)：731-744.

[28] LIEBER D，LORA J，SCHREMPP S，et al.ArabidopsisWIH1 andWIH2 genes act in the transition from somatic to reproductive cell fate[J].Curr Biol，2011，21(12)：1009-1017.

[29] FERNANDEZ-CALVINO L，FAULKNER C，WALSHAW J，et al.Arabidopsisplasmodesmal proteome[J].PLoS ONE，2011，6(4)：18880.

[30] 裴延飛，劉廷利，連梓伊，等.番茄中受TYLCV 誘導上調表達基因tetraspanin3 的功能分析[J].南京農業大學學報，2015，38(6)：896-900.

[31] HUANG S，TIAN H，CHEN Z，et al.The evolution of vertebrate tetraspanins：Gene loss，retention，and massive positive selection after whole genome duplications[J].BMC evolution biology，2012，10：306.

作者簡介趙倩倩(1989- )，女，河南郟縣人，碩士研究生，研究方向：水稻抗病基因的克隆和功能。

收稿日期2016-04-10

中圖分類號Q 946

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)14-146-03

Research Progress of Tetraspanins Protein in Plant

ZHAO Qian-qian,WANG Yu-xin

(College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004)

AbstractTetraspanins (TETs) is a large class of evolutionary conserved proteins with four transmembrane domains, which are widely distributed in all multicellular organisms. In this research, we reviewed the structural characteristics, system evolution of the plant TETs protein, as well as the biological function of model plant Arabidopsis thaliana TETs protein super family and tomato Tetraspanin3 protein, so as to provide references for better research of plant TETs protein super family.

Key wordsTetraspanins; Four transmembrane domain; AtTET1-17; Tetraspanin3