不同晶相的草酸鈣晶體引起腎上皮細胞的毒性差異

孫新園　姚秀瓊　余　凱　歐陽健明（暨南大學生物礦化與結石病防治研究所，廣州　510632）

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不同晶相的草酸鈣晶體引起腎上皮細胞的毒性差異

孫新園姚秀瓊余凱歐陽健明＊
（暨南大學生物礦化與結石病防治研究所，廣州510632）

摘要：采用掃描電子顯微鏡（SEM）、激光共聚焦顯微鏡（LSM）、流式細胞儀、電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP）等方法比較研究了尺寸約1.2 μm的一水草酸鈣（COM）和二水草酸鈣（COD）晶體對非洲綠猴腎上皮細胞（Vero細胞）的損傷差異。COM和COD均能引起Vero細胞的細胞活力和超氧化物歧化酶（SOD）活力降低、丙二醛（MDA）含量升高以及碘化丙啶（PI）紅染細胞數目增多，且均呈現濃度依賴性。在相同晶體濃度時，COM的細胞毒性明顯比COD強，引起細胞表面表達的粘附分子透明質酸（HA）比COD多，粘附量也顯著增加。相比于COM晶體，Vero細胞更容易內吞COD晶體。COM與COD晶體對腎上皮細胞的毒性差異與晶面的離子密度以及細胞與晶體間的靜電作用等因素密切相關。本文結果將有助于從分子水平上和細胞水平上闡釋草酸鈣結石的形成機理。

關鍵詞：一水草酸鈣；二水草酸鈣；細胞毒性；濃度效應

國家自然科學基金（No.21371077）資助項目。

＊通信聯系人。E-mail：toyjm@jnu.edu.cn

0　引言

腎結石是一種臨床常見的多發病，腎中結石的主要組分為草酸鈣（CaOx）［1］，其中一水草酸鈣（COM）的發生率約是二水草酸鈣（COD）的2倍［2］。COD結石與高鈣尿［3-4］，低枸櫞酸水平［5］和高pH值［6］有密切的聯系，而COM結石經常出現在正常尿鈣情況下［7］。

晶體粘附是導致腎結石形成的重要原因之一［8-9］。研究表明，尿微晶通過腎臟的時間只有5～10 min，在滯留時間內，晶體通過生長不足以達到足夠大的尺寸來堵塞管道。晶體的聚集是導致尿微晶尺寸迅速增大的重要原因［10-11］。細胞損傷不但會增加尿微晶在細胞表面的粘附［12-13］，而且能夠促進尿微晶在損傷細胞表面的聚集［14］。研究表明，結石患者尿液中的COM含量常常高于健康對照者，而COD含量則低于對照者［15］，尿液中存在的這種組分差異的原因還不甚明了。前期我們研究了尺寸分別為50、100 nm，1、3和10 μm的COM和COD晶體對非離子表面活性劑（NP-40）的吸附［16］，表明晶體尺寸越小，比表面積越大，對NP-40的吸附量越大；相同尺寸的晶體，COM的吸附量大于COD。

但草酸鈣晶相不同導致的與腎小管上皮細胞間作用機制的差異還有待研究。基于此，本文比較研究了尺寸約1.2 μm的COM和COD晶體對非洲綠猴腎上皮細胞（Vero細胞）的損傷差異及其被細胞粘附和內吞的差異，期望從細胞和分子水平上闡述尿液中不同晶相草酸鈣晶體對腎上皮細胞損傷的機理，為抑制腎結石形成提供新的啟示。

1　實驗部分

1.1材料和儀器

非洲綠猴腎上皮細胞 （Vero細胞）（暨南大學生物制藥基地）；DMEM培養基（Hyclone，海克隆生物化學制品（北京）有限公司）。細胞增生分析試劑盒（CCK-8，日本同仁化學研究所）。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。碘化丙啶（PI）、4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、牛血清白蛋白（BSA）均購自上海碧云天生物技術有限公司；生物素化的透明質酸結合蛋白（bHABP，MERCK公司），異硫氰酸熒光素-親和素（FITC-Avidin，武漢博士德生物工程有限公司），12、24和96孔細胞培養板（NEST，中國）。青霉素、鏈霉素（北京普博生物技術有限公司）。

XL-30型環境掃描電子顯微鏡（ESEM，Phillp公司，荷蘭），樣品噴金處理，測量電壓為15～20 kV日本理學D/max 2400 （Rigaku）X射線衍射儀，Cu靶，Kα射線（λ=0.154 08 nm），石墨單色器，40 kV，30 mA，掃描范圍5°～55°。激光共聚焦顯微鏡（LSM510 META DUO SCAN，ZEISS，德國）。倒置熒光顯微鏡（IX51）（日本奧林巴斯公司）。酶標儀（safireZ，Tecan瑞士）。電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-AES）。

1.2晶體的合成及其懸浮液配制

COM、COD晶體的合成及表征參照文獻［9］進行其尺寸均分別約為1.2 μm。

CaOx晶體懸浮液配制：先將稱好的晶體鋪平照紫外40 min除菌；然后把COM、COD晶體分別分散在一定體積的無血清培養液中，配制成400 μg· mL-1的晶體懸浮液，超聲5 min后再依次稀釋成50、100和200 μg·mL-1，備用。

1.3細胞培養

Vero細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養液在37℃、5%CO2和飽和濕度下培養。細胞傳代采用胰蛋白酶消化法。當細胞達80%～90%匯合后用PBS緩沖液洗滌2次，加入0.25%胰酶-EDTA消化液，置37℃培養箱消化3～5 min，消化適度后，加入10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，充分吹打分散細胞，形成單細胞懸液。

1.4細胞活力檢測

細胞按濃度為1.0×105cells·mL-1、100 μL每孔接種于96孔培養板中孵育24 h。實驗模型分為3組：（A）Vero細胞對照組：不加任何試劑。（B）COM晶體處理組：加入分別含50、100、200和400 μg· mL-1的COM晶體的無血清培養液，孵育6 h；（C COD晶體處理組：加入分別含50、100、200和400 μg·mL-1的COD晶體的無血清培養液，孵育6 h。達到粘附時間后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，于37℃下孵育1.5 h，用酶標儀在450 nm處測量吸光度（A），各個條件下的Vero細胞平行測定3個復孔求A值的平均值。

1.5超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量檢測

細胞按濃度1.0×105mL-1、500 μL每孔接種于24孔培養板，加入10%胎牛血清的DMEM培養液孵育24 h后，改用無血清DMEM培養液孵育12 h同步化。實驗模型分組情況與細胞活力檢測相同。達到作用時間后，取上清液，按SOD試劑盒和MDA試劑盒的說明書分別測定SOD活性和MDA含量。

1.6碘化丙啶（PI）染色檢測

細胞按濃度1.0×105mL-1、100 μL每孔接種于96孔培養板，細胞同步化后，按照上述實驗方法分組。達到作用時間后，吸除培養液，用PBS洗滌細胞3次，加入4 μmol·L-1PI溶液，37℃孵育10 min；再用PBS洗滌3次，最后每孔加入100 μL PBS，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞死亡情況。當細胞核被染成紅色時說明細胞已處于中晚期凋亡或壞死狀態。

PI定量分析：在未進行熒光顯微鏡拍照之前，采用酶標儀測定PI的熒光強度。

1.7透明質酸（HA）表達觀察及熒光強度的定量分析

細胞按濃度1.0×105mL-1、1 mL每孔接種于12孔培養板，細胞同步化后，按照上述實驗方法分組。COM和COD晶體濃度分別為100、200和400 μg· mL-1。達到作用時間后，用PBS洗滌細胞2次，接著用固定液 （由5%冰醋酸、10%福爾馬林和70%酒精組成）固定細胞20 min，然后用PBS洗滌3次，每次5 min，再加入100 μL 5 μg·mL-1的bHABP溶液（配制在3%牛血清白蛋白溶液中，現用現配），4℃條件下孵育過夜；之后用PBS洗滌細胞3次，每次5 min；再加入100 μL異硫氰酸熒光素-親和素（FITC-avidin）染色1 h，用PBS洗滌3次，每次5 min，加入4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液復染4 min，用PBS洗滌3次，每次5 min；最后用抗淬滅劑封片，置于共聚焦顯微鏡下觀察，細胞表面表達透明質酸的地方為綠色，細胞核經DAPI染色為藍色。

HA定量分析：HA的熒光強度由儀器附帶的Axiovision軟件（ZEISS，德國）分析，每個樣品對100個細胞的HA進行定量檢測，取平均值。

1.8掃描電子顯微鏡（SEM）觀察

細胞種板密度和實驗分組與HA檢測相同。達到粘附時間后，吸除上清液，用PBS洗滌3次，2.5%的戊二醛于4℃固定24 h后，用1%OsO4固定，接著用PBS洗滌3次，梯度乙醇（30%、50%、70%、90% 和100%）脫水，最后用乙酸異戊酯固定，固定后的細胞采用CO2臨界干燥，噴金包被。在SEM下觀察晶體粘附和內吞情況。

1.9晶體的粘附量測定

細胞種板密度和實驗分組與HA檢測相同，COM和COD晶體濃度分別為50、100、200和400 μg·mL-1。在4℃下作用6 h后，吸除上清液，取出玻片；用PBS洗滌玻片3次，洗去未粘附的晶體；將玻片置于25 mL燒杯中，加入10 mL濃HNO3和1.0 mL HClO4，在電爐上消化至澄清，繼續加熱至HClO4冒煙，蒸至近干時停止加熱，利用余熱把溶液蒸干，冷卻，加3 mL超純水，混勻待測，同時準備空白組（即10 mL濃HNO3和1.0 mL HClO4的混合溶液），利用電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP）測定鈣離子的濃度，然后換算成CaOx晶體的粘附量。

2　結果

2.1草酸鈣晶體的合成與表征

圖1為制備的COM、COD晶體的SEM照片及XRD圖。由于人體內產生的草酸鈣晶體多為不規則的形貌，因此我們未添加其他的添加劑調控晶體的形貌，從而更好的模擬尿微晶與腎小管上皮細胞間的作用。所合成的COM晶體主要為六邊形，也存在部分不規則形貌，其粒徑為（1.2±0.5）μm（圖1a）。在XRD圖中（圖1c），檢測到晶面間距d=0.595、0.365、0.298和0.236 nm的衍射峰，分別歸屬于COM晶體的（101）、（020）、（202）和（130）晶面。COD晶體主要呈四角雙錐形貌及聚集體形貌，粒徑為（1.2±0.4）μm（圖1b）。在XRD圖中 （圖1d），檢測到d=0.618、0.442、0.278和0.224 nm等處分別歸屬于COD晶體（200）、（211）、（411）和（213）晶面的特征吸收峰，表明所合成的晶體均為純相的COM或COD晶體。

2.2細胞活力、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量變化

圖2a為Vero細胞與不同濃度的COM、COD作用后的細胞活力變化?？梢钥闯?，COM對Vero細胞具有明顯的毒性，并呈現濃度依賴性。隨著COM濃度從0 μg·mL-1增加到400 μg·mL-1，細胞活力從對照組的100%降低到（46.0±3.35）%。相比之下，COD 對Vero細胞的毒性明顯小于COM晶體，即使濃度為400 μg·mL-1的COD與Vero細胞孵育6 h后，其活力僅降至（91.0±2.33）%。

圖1　COM、COD的SEM圖像（a，b）和XRD圖（c，d）Fig.1　SEM images（a，b）and XRD patterns（c，d）of COM and COD crystals

圖2　Vero細胞與COM、COD粘附6 h后細胞生化指標變化Fig.2　Changes of biochemical indicators in Vero cells after exposure to COM and COD crystals for 6 h

SOD是細胞內的一種重要的抗氧化酶，對機體內的氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用，能清除氧自由基，保護細胞免受損傷。生物體內SOD活性的的高低間接反應了機體清除氧自由基的能力［17］。從圖2b可見，Vero細胞粘附COM后SOD活力隨著晶體濃度的增加而顯著下降，說明COM的濃度越高，對細胞的損傷越大。而Vero細胞粘附COD后SOD活力降低不顯著。

與SOD一樣，MDA也是反映細胞損傷程度的一項重要的生化指標。MDA是一種脂質過氧化產物，其含量變化可反映機體內脂質過氧化的程度［18］。Vero細胞粘附COM后，MDA含量隨著晶體濃度的增加而逐步升高（圖2c）；而Vero細胞粘附COD后MDA含量增加很緩慢，說明COM晶體對細胞的脂質過氧化損傷較大，而COD晶體較小。

圖2中3個生化指標的檢測結果表明，COM對細胞造成過氧化損傷顯著大于COD。有文獻表明COM晶體作用于腎上皮細胞將誘發活性氧（ROS）的產生，而ROS可以介導一系列炎癥的發生，激活許多信號分子如p38細胞分裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）、蛋白N-末端激酶 （JNKp）和轉錄因子NF-кB等［19］。這些物質可以導致基因和蛋白質的表達和上調，產生炎癥細胞因子如單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和損傷分子KIM-1［20］，一系列的級聯反應最終導致細胞功能大大受損，造成細胞死亡。

2.3Vero細胞與COM、COD粘附后經碘化丙啶（PI）染色的結果

PI是一種常用的細胞核熒光染色劑，在綠色光（540 nm）的激發下會發出明亮的紅色熒光（600 nm）。PI不能透過正常細胞完整的細胞膜，但是能透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜并與細胞核中的DNA結合。與DNA結合的PI發出的紅色熒光強度是未結合PI的20～30倍。被染色的細胞核越多，說明細胞的死亡率越高［21］。

Vero細胞與COM，COD晶體粘附后經PI染色的結果如圖3所示。隨著COM濃度增大，被PI染色的細胞核越來越多（圖3a～d），說明COM對細胞產生氧化損傷后，導致了Vero細胞的死亡率增大。由于對照組細胞被PI染色的很少，故沒有給出其熒光顯微鏡圖片。而COD晶體濃度增大后引起的紅染細胞核數量遠比COM的少（圖3e～h）。說明COM 對Vero細胞的致死率大于COD晶體。此結果與細胞損傷后的生化指標檢測結果（圖2）一致。

圖3　Vero細胞與不同濃度的COM、COD粘附6 h后PI染色結果Fig.3　Fluorescence images of Vero cells stained by PI after incubating with COM and COD with different concentrations for 6 h

2.4Vero細胞與COM、COD粘附后透明質酸（HA）表達量變化

透明質酸（HA）是一種細胞膜表面的主要粘附分子之一［22］，細胞損傷越嚴重，細胞表面表達的HA越多。圖4為激光共聚焦顯微鏡觀察的Vero細胞與COM、COD粘附后的HA表達情況。與100 μg· mL-1的COM晶體粘附6 h后，Vero細胞周圍呈現明顯的綠色熒光；綠色熒光隨著晶體濃度的增加而增強，尤其是當濃度為400 μg·mL-1時，Vero細胞周圍出現明亮的綠色熒光，強度為971±27，表明此時表達了大量的HA分子。然而，Vero細胞與低濃度的COD粘附后的綠色熒光很弱，只有在晶體濃度400 μg·mL-1時，才出現明顯的綠色熒光，但比相同濃度的COM晶體的弱。

上述結果表明，COM、COD與Vero細胞作用后，都可以誘導粘附分子HA的表達，其表達量均呈現濃度依賴性；且相同濃度下，COM處理組中細胞表面表達的HA的量明顯高于COD處理組，因此COM損傷后的細胞更容易粘附更多的晶體，形成結石的風險更大。

圖4　Vero細胞與不同濃度COM、COD粘附后透明質酸（HA）的表達Fig.4　Hyaluronan（HA）expression in Vero cells after exposure to COM and COD crystals with different concentrations

圖5　Vero細胞與不同濃度COM晶體粘附的SEM照片Fig.5　SEM images of Vero cells after exposure to different concentrations of COM crystals

2.5Vero細胞與COM、COD粘附后的SEM觀察

在低濃度（100 μg·mL-1）時，COM晶體處理組中就有較多的晶體粘附在Vero細胞的表面（圖5a），同時，細胞的微絨毛也粘附有COM晶體（圖5a中箭頭所示）。隨著晶體濃度的增大，不但粘附量逐漸增加，而且晶體的聚集程度也逐漸增加（圖5b，5c）。

相比之下，Vero細胞與COD的粘附量要小得多。低濃度時（100 μg·mL-1）時，粘附的COD晶體較少且幾乎不聚集。隨著COD晶體濃度的增加，粘附的晶體數量有所增大 （圖6b）；當濃度升高到400 μg·mL-1時，粘附的COD晶體也會發生聚集，但只是多個小晶體松散的堆積在一起（圖6c中白色箭頭所示）。同時可以明顯的觀察到Vero細胞對COD晶體的內吞（圖6b，7b），而在COM晶體與細胞作用時，內吞現象不明顯（圖7a）。

圖6　Vero細胞與不同濃度COD晶體粘附的SEM照片Fig.6　SEM images of Vero cells after exposure to different concentrations of COD crystals

圖7　Vero細胞對COM（a）和COD b）晶體內吞的觀察Fig.7　SEM observation of COM（a）and COD（b）endocytosis by Vero cells

圖8　ICP法測定不同濃度COM，COD晶體在Vero細胞表面的粘附量Fig.8　Quantitative analysis of adhesion amount of COM and COD with different concentrations to Vero cells using ICP-AES method

2.6COM、COD的粘附量測定

Vero細胞內吞COM和COD晶體為主動運輸的過程，而在4℃的環境下晶體的內吞過程會受到抑制。為了證實SEM觀察的Vero細胞與COM、COD晶體粘附量的差異，在4℃的條件下，我們采用ICP檢測了不同濃度的COM和COD晶體在細胞表面的粘附量（圖8）。當晶體濃度從50 μg·mL-1增加到100、200和400 μg·mL-1，細胞表面粘附的COM從（35.5±5.5）μg·cm-2持續增加到（48.6±11.6）、（74.3± 22.7）、（109.9±11.4）μg·cm-2。而 COD的粘附量從（22.9±2.3）μg·cm-2依次增加到 （31.3±6.8）、（34.7± 9.1）、（40.0±6.8）μg·cm-2。由此可見，在相同晶體濃度時，COM晶體在Vero細胞表面的粘附量均比COD晶體的高，尤其在400 μg·mL-1時，兩者粘附量的差值達69.9 μg·cm-2。

3　討論

為了比較COM和COD兩種晶相的晶體與腎小管上皮細胞間的作用機制的差異，我們通過CCK-8 和PI染色的方法對細胞的活力進行了分析；通過SOD和MDA含量變化對細胞的氧化損傷進行了評估；并通過SEM和ICP方法觀察和檢測了晶體粘附和內吞的差異。COM和COD晶體都可以誘導Vero細胞的損傷，且呈現濃度依賴性。在相同晶體濃度下，COM晶體表現出比COD晶體更高的細胞毒性，且COM晶體更容易粘附和聚集在細胞的表面。

3.1COM的細胞毒性顯著大于COD

相同濃度下，COM晶體表現出了明顯高于COD晶體的細胞毒性，尤其是高濃度的COM晶體不僅會造成細胞的過氧化損傷，引起SOD活性的顯著降低和MDA含量的明顯升高（圖2b，2c），同時還嚴重破壞了細胞膜的完整性，造成細胞的死亡 （圖3）。高濃度的COM晶體更容易產生聚集（圖5），晶體的聚集會加重對腎上皮細胞產生的損傷作用。有研究者通過觀察草酸鈣結石病人的病理組織切片，發現靠近鈣化和聚集晶體的區域的上皮細胞均明顯遭到破壞［23］。而COD晶體造成的細胞損傷明顯減弱，導致的細胞死亡率較?。?4］。

由于COM和COD晶相的不同，兩種晶體在晶體結構、晶面性質以及結晶水含量等方面都存在差異，這就導致它們表現出的細胞的毒性存在明顯的不同。有研究表明，COM和COD晶體的主要晶面（圖9）與羧基的粘附力大小呈現以下規律：COM（101）＞COD（100）＞COM（010）＞COD（101）［25］，歸因于這4個晶面的鈣離子密度依次降低：COM的（101）和（010）晶面分別有5.42和3.33個Ca2+/nm2；COD的（100）和（101）晶面則分別有4.39和2.25個Ca2+/nm2［26］。這種晶面性質的不同可能是導致COM和COD晶體的細胞毒性存在差異的主要原因，這為COM和COD的病理行為及它們各自晶面的粘附強度之間建立了一個重要的聯系。COM的最主要晶面（101）面與腎上皮細胞間的粘附力最強，導致在細胞表面的大量粘附和聚集，加劇了結石形成的風險。對于COD晶體，其粘附力最強的（100）晶面面積較小，而粘附力最弱（101）晶面面積最大，因此COD晶體與細胞作用時的總的粘附力下降，導致COD與細胞膜間的粘附不牢固，形成的聚集體不穩定，在體內容易被腎小管中的尿液沖走，從而降低了結石形成的風險［26-27］。

圖9　微米級COM、COD的晶體結構模型圖Fig.9　Model diagram of crystal structure of micron-grade COM and COD

3.2Vero細胞內吞COM、COD晶體存在差異

SEM結果可以明顯的觀察到細胞對COD晶體的內吞（圖6b，7b），而這種現象在COM晶體處理組中不明顯。細胞的內吞作用是機體自我保護的一種機制，以去除表面潛在的粘附和聚集位點。內吞的晶體會在細胞內的溶酶體中緩慢溶解，而不再暴露在過飽和的腎管流體中作為晶體聚集的一個位點［28］。細胞對COM晶體的內吞作用弱于COD晶體這可能是因為COM的粘附對細胞產生較嚴重的過氧化損傷（圖2b，2c），細胞膜破裂（圖3），導致細胞正常的內吞功能也受到損害。COM晶體也可能影響了內吞相關蛋白如CLC-5的表達，導致內吞作用減弱，細胞清除晶體的能力降低，從而削弱了細胞膜表面抗晶體粘附和聚集的能力［29］。

4　結論

不同晶相的COM和COD晶體都能引起Ver細胞的細胞活力和SOD活性降低、MDA含量升高以及PI紅染細胞數目增多，且均呈濃度依賴性。在相同晶體濃度時，COM的毒性和損傷作用明顯比COD強，使得Vero細胞表達的粘附分子HA比COD多，更易引起晶體在細胞表面的聚集。同時Vero細胞內吞COD晶體的能力比COM強，進一步減弱了COD對細胞的損傷作用。尿液中COM和COD晶體的大量產生都會引起腎上皮細胞的損傷導致晶體在細胞表面的粘附和聚集。而相同濃度下，COD晶體的產生會極大地減弱晶體對腎臟的損傷，降低結石形成的風險。探索抑制COM晶體形成而促進COD晶體形成的藥物可能是降低結石風險的重要途徑。本文對不同晶相、不同濃度的草酸鈣晶體作用于腎上皮細胞時毒性差異的研究，將會為腎結石的預防和治療提供一定的啟示。

參考文獻：

［1］Moe O W.Lancet，2006，367（9507）:333-344

［2］Mandel N S，Mandel G S.J.Urol.，1989，142:1516-1521

［3］Galán J A，Conte A，Llobera A，et al.Urol.Int.，1996，56:79-85

［4］Parent X，Boess G，Brignon P.Prog.Urol.，1999，9:1051-1056

［5］Asplin J R，Lingeman J，Kahnoski R，et al.J.Urol.，1998，159:664-668

［6］Pierratos A E，Khalaff H，Cheng P T，et al.J.Urol.，1994，151:571-574

［7］Conte A，Genestar C，Grases F.Urol.Int.，1990，45:25-27

［8］Domingos F，Serra A.Scand.J.Urol.，2014，48（5）:414-419

［9］Sun X Y，Ouyang J M，Liu A J，et al.Maert.Sci.Eng.CMater.，2015，57:147-156

［10］Finlayson B，Reid S.Invest.Urol.，1978，15:442-448

［11］Kok D J，Khan S R.Kidney Int.，1994，46:847-854

［12］Wang B，Wu B，Liu J，et al.PLoS One，2014，9（7）:e101306

［13］TAN Jin（談金），DENG Sui-Ping（鄧穗平），OUYANG Jian-Ming（歐陽健明）.Chinese J.Inorg.Chem.（無機化學學報），2010，26（12）:2131-2137

［14］Fujii Y，Okada A，Yasui T，et al.PLoS One，2013，8（4）: e61343

［15］Shapur N K，Uvarov V，Popov I，et al.Urology，2012，80（5）: 980-985

［16］WENXiao-Ling（溫小玲），GANQiong-Zhi（甘瓊枝），OUYANG Jian-Ming（歐陽健明）.Chinese J.Inorg.Chem.（無機化學學報），2015，31（10）:2021-2029

［17］Unterstab G，Gosert R，Leuenberger D，et al.Virology，2010，399:322-331

［18］Thongboonkerd V，Semangoen T，Sinchaikul S，et al.J. Proteome Res.，2008，7（11）:4689-4700

［19］Zuo J，Khan A，Glenton P A，et al.Nephrol.Dial.Transplant.，2011，26（6）:1785-1796

［20］Huang H S，Ma M C，Chen J.Am.J.Physiol-Renal.，2009，296（1）:F34-F45

［21］Schepers M S J，Van Ballegooijen E S，Bangma C H，et al. Kidney Int.，2005，68:1543-1553

［22］Poon N W，Gohel M D I.Carbohydr.Res.，2012，347（1）:64-68

［23］Kramer G，Steiner G E，Prinz-Kashani M，et al.BJU Int.，2003，91（6）:554-559

［24］Yuen J W M，Gohel M D I.Clin.Chim.Acta，2010，411: 1018-1026

［25］Lieske J C，Toback F G，Deganello S.Calcif.Tissue Int.，1996，58:195-200

［26］Sheng X，Ward M D，Wesson J A.J.Am.Soc.Nephrol.，2005，16:1904-1908

［27］Wang T T，Thurgood L A，Grover P K，et al.BJU Int.，2010，106（11）:1768-1774

［28］Grover P K，Thurgood L A，Fleming D E.Am.J.Physiol-Renal.，2008，294:F355-F361

［29］Lieske J C，Norris R，Swift H，et al.Kidney Int.，1997，52: 1291-1301

中圖分類號：R69；R329.2+8

文獻標識碼：A

文章編號：1001-4861（2016）05-0818-09

DOI：10.11862/CJIC.2016.097

收稿日期：2016-01-14。收修改稿日期：2016-03-04。

Toxicity Difference of Calcium Oxalate of Different Crystal Phases on Renal Epithelial Cells

SUN Xin-YuanYAO Xiu-QiongYU KaiOUYANG Jian-Ming＊
（Institute of Biomineralization and Lithiasis Research，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Abstract：Scanning electron microscope（SEM），laser confocal microscope（LSM），flow cytometry，inductively coupled plasma emission spectrometer（ICP）methods were used to comparatively study the cell injury differences on the African green monkey kidney epithelial（Vero）cells by calcium oxalate monohydrate（COM）and dihydrate （COD）crystals with a size about 1.2 μm.Both COM and COD could decrease the cell viability and superoxide dismutase（SOD）activity，increase malondialdehyde（MDA）content and the number of red dye cells staining with propidium iodide（PI）in a dose-dependent manners.Compared to COD crystals，COM crystals induced significantly higher toxicity under the same crystal concentration，and COM crystals caused more adhesion molecules hyaluronic acid（HA）expression and higher adhesion amount than COD crystals.The ability of the Vero cells to endocytose COD crystal was stronger than that of COM.The cytotoxicity difference between COM and COD was closely related to ion density of crystal face and electrostatic interactions between the cell and crystals.The results in this paper can help to explain the formation mechanism of calcium oxalate stones at the molecular level and cellular level.

Keywords：calcium oxalate monohydrate；calcium oxalate dihydrate；cytotoxicity；concentration effect