郭秀秀

【摘 要】 目的：建立復方甲苯咪唑乳膏的微生物限度檢查方法。方法：按《中國藥典》2015年版第三部通則非無菌微生物限度檢查法規定的常規法進行驗證。結果：銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌以常規法驗證回收率均大于70%，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌菌液對照組和試驗組生長良好。結論：需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的計數采用常規的平皿傾注法，控制菌的檢查采用常規法。

【關鍵詞】 復方甲苯咪唑乳膏；微生物限度檢驗法；藥品檢驗

【中圖分類號】R286.0 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）11-0012-02

復方甲苯咪唑乳膏用于驅除蛔蟲、蟯蟲，其主要成分為鹽酸左旋咪唑和甲苯咪唑。為了保證所采用的檢驗方法適合于該藥品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的計數以及控制菌的檢查，確認供試液制備、測定方法及檢測系統適用于該藥品的檢驗。研究參照《中國藥典》[1]2015年版第三部通則“1105 非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”以及“1106 非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法”、《中國藥品檢驗標準操作規范》[2]，建立復方甲苯咪唑乳膏微生物限度檢驗方法，并進行方法適用性試驗，現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 試驗環境 根據2015年版《中國藥典》第三部“9203藥品微生物質量管理原則”[3]規定，試驗在環境潔凈度B級、局部潔凈度A級的單向流空氣的無菌室進行，陽性菌操作在符合國家Ⅱ級生物安全標準的生物安全柜內進行。

1.2 儀器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州蘇凈儀器自控設備有限公司）；GHP-9162型電熱恒溫培養箱（上海金慧科電子有限公司）；MJX-160B-Z型微電腦霉菌培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；DYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海市博訊實業有限公司醫療設備廠）；TZQ-Ⅱ型勻質器型號（天津市津德實驗儀器技術開發中心）。

1.3 材料 復方甲苯咪唑乳膏（批號：160101、160102、160103，宿州億帆藥業有限公司），0.1%無菌吐溫溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（自配），胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號：20151210-00）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號：20160111-00）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號：20151110-00）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號：20150716-00）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號：20151026-00）、沙氏葡萄糖液體培養基（SDB，批號：20151112-00）等均由杭州微生物試劑有限公司提供。

1.4 試驗菌種 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B） 10 104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B） 63 501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26 003]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003]等由中國醫學菌種保藏中心和中國藥品生物制品檢定所提供，試驗用菌株的傳代次數為3代。

2 方法與結果

2.1 菌懸液的制備及菌懸液菌落數的檢查

2.1.1 菌懸液的制備 取經35℃培養18～24h的銅綠假單胞菌的TSB培養物1ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋至10-6備用，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌用同樣方法分別稀釋至10-5和10-8備用，取經25℃培養2～3天的白色念珠菌的SDB培養物1ml，用上述方法稀釋至10-5，備用；取經25℃培養1周的黑曲霉斜面培養物，加4mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋至10-6，備用。

2.1.2 菌懸液中菌落數的檢查 取“2.1.1”銅綠假單胞菌10-6級菌懸液、枯草芽孢桿菌10-5級菌懸液、金黃色葡萄球菌10-8級菌懸液各0.1ml，分別用已滅菌的45℃胰酪大豆胨瓊脂培養基20ml注皿，各平行測定兩皿；取2.1.3白色念珠菌10-5級菌懸液、黑曲霉10-6孢子菌懸液各0.1ml，分別用已滅菌的45℃胰酪大豆胨瓊脂培養基和已滅菌的45℃沙氏葡萄糖瓊脂培養基20ml注皿，各平行測定兩皿，按《中國藥典》2015年版規定溫度培養一定時間，計數，均應不大于100cfu/ml；實測結果見表1，符合要求。

2.2 供試液制備 取本品最小包裝兩支（10g/支），按微生物限度檢查法規定稱取10g，加40℃無菌0.1%吐溫溶液至100ml，勻漿儀2000轉/min，3min混勻，即為1∶[KG-*2]10的供試品溶液。

2.3 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法的適用性試驗

2.3.1 采用常規法（即平皿傾注法） 進行3次獨立的平行試驗。

2.3.1.1 試驗組 取5支裝有1∶[KG-*2]10供試液的試管，分別加“2.1.1”試驗菌液0.1ml，使每1ml供試液中含菌量不大于100cfu，分別取上述試驗液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，立即注入20ml溫度不超過45℃熔化的無菌胰酪大豆胨瓊脂培養基或無菌沙氏葡萄糖瓊脂培養基，平行制備2個平皿，待凝固后置規定溫度培養3～5d，逐日觀察結果并記錄。

2.3.1.2 菌液對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，按試驗組操作。

2.3.1.3 供試品對照組 取“2.2”制備好的供試液，以無菌0.1%吐溫溶液代替菌液同試驗組操作。

2.3.1.4 陰性對照 取無菌0.1%吐溫溶液1ml置90mm的無菌平皿中，立即注入20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基，平行制備2個平皿，待凝固后置規定溫度培養3～5d，逐日觀察結果并記錄。

從表2、表3可知，3次平行試驗，試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值與菌液對照組平均菌落數的比值均在0.5～2范圍內。

2.4 控制菌檢查方法的適用性試驗 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查方法的適用性試驗：按常規法進行三次平行試驗。

2.4.1 試驗組 分別取“2.2”中1∶[KG-*2]10供試液10ml及上述不大于100cfu/ml的銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌1ml，分別接種置90ml胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，置35℃培養18～24h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

2.4.2 菌液對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，同試驗組操作。

2.4.3 供試品對照組 取1∶[KG-*2]10供試液10ml，以0.1%無菌吐溫溶液代替菌液同試驗組操作。

2.4.4 陰性對照組 取無菌0.1%吐溫溶液11ml，接種置90ml胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，置35℃培養18～24h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

由表4方法驗證結果可以看出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌菌液對照組、試驗組生長良好，說明復方甲苯咪唑乳膏對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌無抑菌作用或抑菌作用較弱。

3 討論

3.1 由上述驗證結果可知，三批復方甲苯咪唑乳膏在需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數檢查的方法適用性試驗中，平皿法對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌的回收試驗均符合要求；從表4可知，控制菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查可采用常規法檢查。

3.2 培養基影響 本次驗證所用培養基均由杭州微生物試劑有限公司提供，在驗證前每批培養基均應進行無菌及性能檢查，符合2015版《中國藥典》要求方可用于微生物方法驗證。

3.3 菌種及菌液影響因素 《中國藥典》2015年版要求選用標準菌株，實驗所用黑曲霉菌株由中國藥品生物制品檢定所提供，其他菌株由中國醫學菌種保藏中心提供，均選用第3代為試驗菌，符合《中國藥典》2015版實驗菌株不得超過5代的標準。菌懸液制備完成后立即使用，未超過《中國藥典》2015年版規定的“菌液制備后室溫下放置，應在2h內使用”的要求。

3.4 培養條件影響因素 《中國藥典》2015年版規定需氧菌用胰酪大豆胨瓊脂培養基，培養溫度30℃～35℃，培養時間不得超過3d，實驗取33℃，培養3d，符合要求。霉菌和酵母菌采用沙氏葡萄糖瓊脂培養基，20℃～25℃培養時間不超過5d，本實驗采用25℃培養5d，符合要求。

3.5 稀釋劑的影響 因乳膏供試品不易混和均勻，故實驗過程中采用0.1%無菌吐溫溶液溶解供試品，再用勻漿儀進行攪拌混合。然后用pH7.0無菌氯化鈉未檢出蛋白胨緩沖液（自配）稀釋到合適稀釋級，符合《中國藥典》2015年版油脂類供試品處理要求。

3.6 菌落計數是方法驗證實驗過程中極為重要的一步，實驗采用含菌量不大于100cfu/ml菌懸液，計數時應仔觀察，必要時可借助放大鏡、兩人復核等方法，減少操作誤差。

參考文獻

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（三部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：80-90.

[2]中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：351-369.

[3]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（三部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：220-221.

（收稿日期：2016.04.11）