鹽地堿蓬2個DREB1/CBF基因的克隆與表達調控分析

孫曉波，蘇家樂，賈新平，梁麗建，肖　政，鄧衍明

（江蘇省農業科學院園藝研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，南京 210014）

?

鹽地堿蓬2個DREB1/CBF基因的克隆與表達調控分析

孫曉波，蘇家樂，賈新平，梁麗建，肖政，鄧衍明

（江蘇省農業科學院園藝研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，南京 210014）

摘要：【目的】從鹽地堿蓬（Suaeda salsa L.）中克隆2個DREB1/CBF，分析其序列特征、編碼蛋白的亞細胞定位和轉錄激活活性，以及在非生物脅迫下的表達模式，為進一步研究鹽地堿蓬的抗逆機制提供依據。【方法】利用同源克隆法獲得鹽地堿蓬2個DREB1/CBF片段，采用RACE技術克隆獲得cDNA全長序列，分別命名為SsCBF1 和SsCBF2。運用生物信息學軟件對2個SsCBF及其編碼蛋白進行分析，并將它們分別與GFP融合構建植物表達載體，通過基因槍轉化法導入洋蔥表皮細胞進行瞬時表達，觀察它們編碼蛋白的亞細胞定位。利用酵母單雜交系統研究2個SsCBF與DRE/CRT順式作用元件的結合特異性和轉錄激活活性。采用Real time-PCR研究2個SsCBF在低溫、NaCl、PEG以及ABA處理下的表達模式。【結果】 SsCBF1編碼一個225個氨基酸的蛋白，預測分子量為25.4 kD，理論等電點為4.84。SsCBF2編碼一個由260個氨基酸組成的蛋白，預測分子量為28.6 kD，理論等電點為5.05。SsCBF1和SsCBF2均含有1個典型的AP2/ERF保守結構域，在核苷酸和氨基酸水平上分別具有53.5％ 和45.4％的同源性，而2個基因的AP2/ERF結構域在核苷酸和氨基酸水平上分別具有76.2％和 87.3％的相似性。SsCBF1、SsCBF2歸屬于DREB亞組的A-1組，定位于細胞核內，均能與DRE/CRT順式作用元件特異性結合，并激活下游報告基因的表達。低溫、干旱、高鹽和ABA能夠誘導SsCBF1表達，而SsCBF2在低溫處理下表達量上調，但對干旱、高鹽和ABA處理不響應。【結論】SsCBF1和SsCBF2是鹽地堿蓬的2個脅迫應答轉錄因子。在鹽地堿蓬中，SsCBF1通過依賴ABA途徑參與對高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫的應激調控，而SsCBF2則通過不依賴于ABA途徑對低溫脅迫產生響應。

關鍵詞：鹽地堿蓬；DREB1/CBF轉錄因子；亞細胞定位；酵母單雜交；熒光定量PCR

聯系方式：孫曉波，E-mail：sunxiaobojaas@163.com。通信作者鄧衍明，E-mail：nksdym@163.com

0 引言

【研究意義】鹽地堿蓬（Suaeda salsa L.）為藜科堿蓬屬真鹽生植物，在中國分布廣泛，可用于食品、飼料、醫藥等，是一種非常有價值的野生植物資源。鹽地堿蓬不僅是典型的鹽堿地指示植物［1］，還兼具耐旱［2］、耐澇［3］等特性，是研究植物抗逆機制理想的基因庫［4］。但目前對它的研究主要集中于人工栽培［2，5］、生理生化［6-7］、營養組成成分分析［8-9］和組織培養［10-11］等方面，其抗逆機理及與抗逆相關基因還沒有得到很好的挖掘和研究。DREB/CBF轉錄因子是目前研究最深入的抗逆相關轉錄因子，在植物對逆境脅迫的響應和耐性方面起關鍵作用［12-13］。克隆鹽地堿蓬DREB/CBF，分析它們的序列特征、編碼蛋白的亞細胞定位和轉錄激活活性，以及經高鹽、干旱、低溫和 ABA處理后的表達模式，對研究鹽地堿蓬抗逆機制具有積極作用，為完善植物抗逆機理提供新的理論基礎，同時也可為其他大宗農作物抗逆性狀的遺傳改良和種質創新提供新的基因資源。【前人研究進展】DREB/CBF轉錄因子是乙烯應答元件結合蛋白（AP2/EREBP）轉錄因子家族中的一個亞家族。在一些高鹽、干旱和低溫等脅迫應答基因啟動子中，存在一至多個DRE/CRT順式作用元件，DREB/CBF能與其特異性結合，激活下游抗逆功能基因的表達，從而增強植物對不良環境的抗性［14-15］。DREB/CBF家族蛋白可進一步分為A-1—A-6 6個亞組，其中A-1和A-2是2個最大的亞組，包括DREBl/CBF和DREB2兩類基因，分別在冷脅迫及脫水和鹽堿脅迫應答中起核心作用［14，16-17］。DREBl/CBF在植物中廣泛存在，已陸續在擬南芥、油菜、大麥、水稻、番茄、黑麥草和大豆等多種甜土植物及一些鹽生植物中被發現［18-25］。研究表明，DREB/CBF均含一個約由60個氨基酸殘基組成的AP2/ERF保守結構域，包括YRG和RAYD 2個保守區。YRG為N端堿性親水區，由19—22個氨基酸殘基形成3個反向平行β折疊，有利于與DNA結合；其中第2個β折疊中的第14位纈氨酸（V）和第l9位谷氨酸（E）是決定DREB/CBF 與DRE/CRT特異性結合的關鍵位點［18， 26-27］。RAYD位于AP2/ERF的C端，含有一個由18個氨基酸形成的雙親 α螺旋酸性核心區域；其并不直接參與對DRE/CRT的特異識別，而是通過影響YRG的構象或通過與其他蛋白的相互作用來調節AP2/ERF與DNA的結合［26， 28］。不同DREBl/CBF蛋白的羧基端均存在一個“LWSY”保守序列，同時在AP2/ERF末端包含一個“DSAWR”保守序列，這兩個保守序列是區分A-1組和其他 5個亞組 DREB蛋白的特征序列［15，17，19］。DREB1/CBF蛋白N-端一般含有1個保守的富含堿性氨基酸的核定位信號PKKR/PAGRxKFxETPHP；C-末端富含酸性氨基酸，被認為是轉錄激活區。【本研究切入點】目前，鹽地堿蓬中與抗逆相關基因的研究主要集中在與滲透平衡、離子平衡和去除活性氧等相關的基因，關于鹽地堿蓬DREB轉錄因子的報道還很少［29-32］，而有關DREB1/CBF參與鹽地堿蓬非生物脅迫應答的研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究采用同源克隆法獲得2個DREB1/CBF cDNA片段，在此基礎上，利用RACE技術分離克隆這兩個基因的cDNA全長，同時對它們編碼蛋白的特性、保守結構域、亞細胞定位、與DRE/CRT結合的特異性與轉錄激活活性及在不同逆境脅迫下的基因表達模式進行分析與檢測，為探討鹽生植物鹽地堿蓬的抗逆機制積累資料，同時也為通過基因工程改良植物抗逆性提供候選基因。

1 材料與方法

試驗于2013年5月至2014年12月在江蘇省農業科學院室內進行，田間樣本采集分別在2013年4—9月和2014年4—9月在江蘇省農業科學院灘涂試驗地進行。

1.1 材料

試驗所用材料為鹽地堿蓬，取自江蘇省農業科學院灘涂試驗地。

將生長至10 cm（未有樹生分枝）高的鹽地堿蓬幼苗分 3部分處理，一部分幼苗提取肉質莖基因組DNA和總RNA，用于2個SsCBF的克隆；一部分幼苗被從培養土中取出，用無菌水沖洗干凈，于 1/2 Hoagland營養液中過渡培養15 d，再分別轉移至含有400 mmol·L-1NaCl、20 ％ PEG 6000和100 μmol·L-1ABA的1/2 Hoagland營養液中培養，并分別于0、0.5、2、4、8、12和24 h后剪去肉質莖以提取其總RNA，用于Real-time PCR分析；一部分幼苗移入光照培養箱進行 4℃低溫處理，在處理 0、0.5、2、4、8、12 和24 h后取肉質莖并提取總RNA，用于Real-time PCR分析。

1.2 SsCBF1和SsCBF2片段的同源克隆

用植物基因組提取試劑盒提取鹽地堿蓬基因組DNA。利用DNAMAN6.0軟件比較NCBI數據庫中已有植物DREB1/CBF的AP2/ERF結構域，從中選取2條保守氨基酸序列TRHPVYRGV和ACLNFADS設計1對簡并引物，正向引物CBF-S：5′-ACG（A/T/C）A（C）GG（A/T/C）CAC（T）CCG（A/T/C）GTG（A/T/C）TAC（T）A（C）GG（A/T/C）GGG（A/T/C）GT-3′，反向引物CBF-AS：5′-GAA（G）TCG（A/T）GCA（G）AAA（G）TTG（A/T/C）AA（G）A（G）CAG（A/T/C）GC-3′。以鹽地堿蓬基因組為模板，采用PCR聚合酶鏈式反應擴增AP2/ERF保守區同源序列。PCR反應體系為2.5 μL 10×PCR緩沖液、1.0 μL dNTP（脫氧核苷酸混合物，10 mmol·L-1）、正、反向引物10 μmol·L-1各1.0 μL、1.0 μL基因組DNA（濃度50 ng·μL-1）、0.25 μL LA-Taq酶和18.25 μL雙蒸水。PCR反應條件為95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃1 min，35個循環；72℃ 10 min。PCR產物回收后與pMD18-T（TaKaRa）載體連接，轉化，挑取白色菌斑，經 PCR篩選和酶切鑒定后送往上海生物工程公司進行測序鑒定。最終獲得2條SsDREB1/CBF片段。

1.3 SsCBF1和SsCBF2的cDNA全長序列的獲得

取經4℃低溫處理的鹽地堿蓬肉質莖，用SV Total RNA lysis試劑盒（Promega）提取總 RNA，并經DNaseⅠ消化去除DNA。通過測定其OD260/280比值和1％瓊脂糖凝膠電泳比值，分析檢測所提取總RNA的純度、濃度及其完整性。以總 RNA為模板，采用Invitrogen公司5′/3′ RACE System（version2. 0）試劑盒克隆基因的末端序列。反轉錄引物使用3′AP（表1）。

為獲得SsCBF1和SsCBF2的3′端序列，根據已獲得的核苷酸序列，分別設計2條3′RACE特異性巢式引物 SsCBF1-3′GSP1、SsCBF1-3′GSP2和 SsCBF2-3′GSP1、SsCBF2-3′GSP2（表1），參照3′RACE試劑盒（Invitrogen）說明進行擴增，目標 PCR產物即為SsCBF1和SsCBF2的3′序列。設計2條5′RACE特異性巢式引物 SsCBF1-5′GSP1、SsCBF1-5′GSP2和SsCBF2-5′GSP1、SsCBF2-5′GSP2（表1），參照5′RACE試劑盒（Invitrogen）說明進行基因序列 5′RACE，目標PCR產物即為SsCBF1和SsCBF2的5′序列。確定目的片段的大小并用凝膠回收試劑盒對其進行回收，轉化，挑取白色菌斑，經PCR篩選和酶切鑒定后送往上海生物工程公司進行測序鑒定。

使用DNAMAN軟件將已知的中間序列與3′端和5′端序列進行拼接獲得SsCBF1和SsCBF2的cDNA全長序列。在拼接的2條全長序列兩端分別設計擴增全長所需引物 SsCBF1-S、SsCBF1-AS和 SsCBF2-S、SsCBF2-AS，以cDNA為模板進行PCR擴增，回收，連接，測序，與拼接序列進行比對，獲得SsCBF1和SsCBF2的全長序列，并將2條序列提交到GenBank。

1.4 SsCBF1和SsCBF2的生物信息學分析

對鹽地堿蓬SsCBF1和SsCBF2的堿基序列和所編碼的氨基酸序列進行分析。通過 BLAST X和BLAST P搜索NCBI的核苷酸和蛋白質數據庫，進行序列相似性分析及氨基酸保守性預測；ORF finder程序尋找開放閱讀框；采用 ProtParam計算蛋白質的相對分子量和理論等電點；使用ClustaW1.83軟件進行多重序列比對；利用 Mega5.1軟件，采取 Neighbor-Joining法構建系統進化樹；采用SignalP 4.0 Server預測蛋白的信號肽；利用TMHMM Server v.2.0軟件對基因編碼的氨基酸跨膜結構域進行預測和分析；ProtScale以默認算法（Hphob./Kyte & Doolittle）對蛋白進行親疏水性預測；ExPaSy-SOPMA軟件分析蛋白質的二級結構。

表1　RACE-PCR 擴增所用引物列表Table 1 List of primers used for RACE-PCR amplification

1.5 SsCBF1和SsCBF2的亞細胞定位

以SsCBF1和SsCBF2陽性克隆提取的質粒作為模板，分別以SsCBF1-OF1：5′-CCCAAATCCAATGG ATAATAATTATGGGCAGCAC-3′，SsCBF1-OF2：5′-TTACGCTGAGAAACTCCACAGTGA-3′和 SsCBF2-OF1：5′-CCCAAATCCAATGGACGTCTATTACAAC AACACC-3′，SsCBF2-OF2：5′-TCAAATGGAGTTGG AGTAACTCCA-3′作為引物擴增SsCBF1和 SsCBF2的編碼區序列，將 PCR產物分別亞克隆至 pXDG-vector［33］GFP的下游，構建CaMV35S啟動子驅動的攜帶有GFP和SsCBF1融合基因及GFP和SsCBF2融合基因的瞬時表達載體 pXDG-GFP-SsCBF1和pXDG-GFP-SsCBF2。切取2 cm×2 cm的洋蔥內表皮組織置于固體平板MS培養基，28℃弱光下預培養 4—6 h后待用。采用 Bio-RAD公司 Model PDS-1000/He型基因槍進行轟擊，每皿轟擊1次，基因槍轉化步驟參照參考文獻［32］。將轟擊后的洋蔥內表皮細胞在MS培養基上25℃黑暗培養16—18 h后取出，在德國ZEISS LSM 510 META型激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光在細胞中的表達部位，利用計算機拍攝和存貯圖像。以pXDG-vector載體作為陽性對照。

1.6 酵母單雜交

將人工合成的1條含有3個DRE/CRT核心序列的核酸序列及它的1條突變體核酸序列克隆到酵母的報告質粒pHIS2.1（Clontech公司），獲得的DRE/CRT元件陽性質粒pHIS2. 1-DRE和mDRE元件陽性質粒pHIS2.1-mDRE［34］。根據SsCBF1和SsCBF2的編碼序列分別設計1對引物，在正向和反向引物的兩端分別引入XhoⅠ和SmaⅠ酶切位點，以SsCBF1和SsCBF2 的cDNA為模板進行PCR擴增。擴增產物經雙酶切后與同樣雙酶切的酵母表達載體YepGAP（不帶GAL4 AD 激活區）［27］連接，獲得的陽性質粒分別命名為YepGAP- SsCBF1和YepGAP- SsCBF2。將構建好的2個表達載體分別與報告載體 pHIS2.1-DRE/pHIS2.1-mDRE共同轉化酵母菌株Y187，在SD/-His-Ura-Trp平板上篩選轉化子，獲得的陽性克隆在 SD/-His-Ura-Trp+10 mmol·L-13-AT平板上進行檢測。空 YepGAP載體作為陰性對照。

1.7 熒光定量PCR分析

根據SsCBF1和SsCBF2全長cDNA序列，選取不含保守序列的3′端核酸序列設計熒光定量PCR引物SsCBF1-qf：5′-CAGAATACATGGATGAGGAG-3′，SsCBF1-qr：5′-GAGACTTCATAGTCACTGTC-3′和SsCBF2-qf：5′-GCAGACAGTAGAAGTATCAG-3′，SsCBF2-qr：5′-CGATAGCAGTAGTAGTGGTG-3′。以鹽地堿蓬Actin（GenBank登錄號FJ587488）作內參，設計引物Ss-ActinF：5′-ACCGTTCCAATCTATGAGG -3′和 Ss-ActinR：5′-CGTAAGCCAACTTCTCCT-3′。利用羅氏Light Cycler 2.0型熒光定量PCR儀，參考SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，Japan）試劑盒說明書，采用三步法進行Real-time PCR：95℃ 30 s；95℃5 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，45個循環；60—95℃，每次上升0.5℃進行溶解曲線分析；72℃收集熒光信號。每個樣品進行 3次重復，取其平均值。采用 2-ΔΔCt法進行數據的相對定量分析。

2 結果

2.1 鹽地堿蓬SsCBF1和SsCBF2的克隆與結構分析

為獲得鹽地堿蓬DREB1/CBF AP2/ERF結構域的部分序列，采用DNAMAN6.0軟件比較NCBI數據庫中已有植物DREB1/CBF的AP2/ERF結構域，從中選取2條保守氨基酸序列TRHPVYRGV和ACLNFADS設計一對簡并引物，以鹽地堿蓬基因組為模板進行PCR擴增，獲得1條約180 bp的PCR片段，經測序分析發現PCR產物中包含2種DREB1/CBF片段。根據這兩個 DREB1/CBF片段測序結果設計 5′/3′RACE引物，分別經過兩輪巢式PCR擴增，獲得它們的cDNA全長，分別命名為SsCBF1（GenBank登錄號為KM679415）和SsCBF2（GenBank 登錄號為KM679416）。SsCBF1的cDNA全長1 105 bp，編碼區長675 bp，編碼225個氨基酸，蛋白分子量（MW）為25.4 kD，理論等電點（pI）為4.84；SsCBF2的cDNA全長952 bp，編碼區長780 bp，編碼260個氨基酸，蛋白分子量（MW）為28.6 kD，理論等電點（pI）為5.05。

搜索NCBI SMART網站進行蛋白質結構功能域分析，結果顯示這兩個蛋白均含有1個典型的由60個氨基酸組成的 AP2/ERF保守結構域。將這 2個AP2/ERF結構域提交到SWISS MODEL（http：// swissmodel.expasy.org）在線程序，以AtERF-1（PDB ID： 1gcc.1.C）分子模型為基礎進行三維結構預測，結果顯示這兩個結構域均含有3個反向平行的β折疊和一個 α螺旋（圖 1）。多序列比對結果顯示，SsCBF1和SsCBF2序列差異較大，尤其是在N-末端和 C-末端，在核苷酸和氨基酸水平上分別具有53.5％和 45.4％的同源性；而 2個基因的 AP2/ERF結構域同源性很高，在核苷酸和氨基酸水平上分別具有76.2％和87.3％的相似性。SsCBF1和SsCBF2 在AP2/ERF結構域上游均含有1個保守的核定位信號“PKKRAGRKKFKETPHP”，而C-末端均富含酸性氨基酸（圖2）。SsCBF1 AP2/ERF結構域第2個β折疊中第14位為纈氨酸，第19位為脯氨酸；AP2/ERF結構域下游含有序列“DSAWR”，羧基末端含有序列“LWSF”。SsCBF2 AP2/ERF結構域第2個β折疊中第14位和第19位分別為纈氨酸和谷氨酸；AP2/ERF結構域下游含有序列“DSSWR”，羧基末端含有序列“LWSY”（圖2）。

圖1　SsCBF1蛋白（a）和SsCBF2蛋白（b）的三級結構Fig. 1 Tertiary structures of SsCBF1 protein （a） and SsCBF2 protein （b）

2.2 鹽地堿蓬SsCBF1、SsCBF2蛋白序列同源性和系統進化分析

利用 BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）將SsCBF1和SsCBF2蛋白序列與GenBank中的蛋白序列比對分析發現，它們與多種植物DREB的氨基酸序列具有同源性（圖 2），SsCBF1與小葉楊PsCBF4（Populus simonii，AIU92947）、河北楊PhCBF4a、桃PpCBF1、薔薇雜交栽培種Rh-DREB1B、馬鈴薯StCBF3、野生番茄ShCBF1和擬南芥AtCBF4的氨基酸序列一致性為48.7％—53％；SsCBF2與這些DREB氨基酸序列一致性為 42.2％—48.9％，低于SsCBF1與它們的同源性。

圖2　SsCBF1、SsCBF2與其他7種植物A-1組DREB的氨基酸序列比對Fig. 2 Comparison of the deduced amino acid sequences of SsCBF1 and SsCBF2 with homologs from 7 other plants

以擬南芥145個AP2/ERF轉錄因子的分類為基礎［18］，利用MEGA5.1軟件對SsCBF1、SsCBF2和其他物種的DREB/CBF構建進化樹（圖3）。結果顯示，SsCBF1和SsCBF2歸屬于 DREB亞組的A-1組，SsCBF1與桃的PpCBF1和楊樹的PnDREB69親緣關系最近，而 SsCBF2與馬鈴薯的 StCBF3和番茄的ShCBF1親緣關系最近。

2.3 SsCBF1和SsCBF2的亞細胞定位

將構建好的2個GFP-SsCBF瞬時表達載體分別與金粉混合制備成混合液，經基因槍轟擊轉化洋蔥表皮細胞后，于25℃黑暗培養16—18 h，使用激光共聚焦顯微鏡在488 nm波長下觀察洋蔥表皮細胞綠色熒光分布情況（圖4）。在含空載體35S：：GFP的洋蔥表皮細胞中，綠色熒光蛋白在細胞膜、細胞核及細胞質中均有表達（圖4-A—圖4-C）；而在表達GFP-SsCBF1融合蛋白（圖4-D—圖4-F）和GFP-SsCBF2融合蛋白（圖4-G—圖4-I）的洋蔥表皮細胞中，綠色熒光僅在細胞核內被觀察到，這一結果與用SignalP 4.0對它們信號肽的預測結果一致。

2.4 SsCFB1和SsCFB2在酵母中的功能驗證

利用酵母單雜交系統檢測SsCFB1和SsCFB2編碼蛋白在酵母細胞內對DRE/CRT的結合特異性和轉錄激活活性。將構建好的 YepGAP-SsCBF1和 YepGAPSsCBF2載體分別和pHIS2.1-DRE/pHIS2.1-mDRE載體共同轉化酵母菌株 Y187，在SD/-His-Ura-Trp平板上篩選轉化子，將獲得的陽性克隆進一步在SD/-His-Ura-Trp+10 mmol·L-13-AT平板上進行檢測，觀察它們生長狀況（圖5-A和圖5-B）。結果表明，同時含有pHIS2.1-DRE和YepGAP-SsCBF1的酵母細胞能夠在缺少組氨酸并加入10 mmol·L-13-AT的培養基上生長，而含有 pHIS2.1-mDRE和 YepGAPSsCBF1的酵母細胞不能在相應的篩選培養基上生長；同時含有pHIS2.1-DRE和YepGAP-SsCBF2的酵母細胞也能夠在缺少組氨酸并加入10 mmol·L-13-AT的培養基上生長，而含有pHIS2.1-mDRE和YepGAPSsCBF2的酵母細胞不能在相應的篩選培養基上生長。作為陰性對照，同時含有pHIS2.1-DRE載體（或pHIS2.1-mDRE載體）和YepGAP空載體的酵母細胞在篩選培養基也都不能生長（圖 5-B）。以上結果表明鹽地堿蓬 SsCFB1和 SsCFB2編碼的蛋白均具有DNA結合域和轉錄激活功能，能夠與DRE/CRT元件特異性結合，并激活其下游基因的表達。

圖3　SsCBF1、SsCBF2與已知DREB的系統進化樹分析Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of SsCBF1 and SsCBF2 with other plant DREBs

圖4　GFP-SsCBF1和GFP-SsCBF2融合蛋白在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位Fig. 4 Subcellular localization of the GFP-SsCBF1 and GFP-SsCBF2 fusion proteins in onion skin cells

圖5　SsCFB1和SsCFB2對DRE/CRT元件特異性結合能力及轉錄激活功能的檢測Fig. 5 Analysis of DRE/CRT binding activity and transactivation ability of SsCFB1 and SsCFB2

2.5 SsCBF1和SsCBF2在鹽地堿蓬中響應非生物脅迫的表達特性分析

通過 Real-time PCR對多種脅迫下 SsCBF1和SsCBF2在肉質莖中的表達豐度進行檢測（圖 6）。結果表明，SsCBF1的表達量在NaCl處理0.5 h迅速提高到對照的7.6倍，2 h后下降為對照的2.1倍，4 —24 h基本維持在對照水平的1.5—2倍，在48 h時恢復到未處理前水平；而SsCBF2的表達量在NaCl處理前后沒有顯著變化。SsCBF1在PEG處理下的表達模式與NaCl處理下的表達模式基本相似，表達量在處理0.5 h后劇烈升高到對照的68.4倍，2 h后下降為對照的22.8倍，4—12 h下降為對照的1.2—2.4倍，在處理48 h時表達量又逐漸升高到對照的6倍；而SsCBF2在PEG處理下維持組成型表達。低溫處理能夠誘導SsCBF1和SsCBF2的表達。SsCBF1的表達水平在低溫處理2 h升高到對照的2.7倍，然后逐漸降低，在12 h又升高到對照的5.4倍，在48 h時下降到未處理前水平；SsCBF2的表達水平在低溫處理下逐漸升高，在處理8 h達到最高，為對照的4.3倍，然后逐漸下降，48 h下降到對照的1.9倍。ABA處理能誘導SsCBF1的表達，在處理2 h時達到最高，為對照的4.5倍，在處理4—48 h時表達量逐漸下降，在48 h時為對照的57％；SsCBF2的表達水平在ABA處理前后沒有明顯變化。

圖6　NaCl、PEG、4℃和ABA短期處理對SsCBF1和SsCBF2表達的影響Fig. 6 The expression analyses of SsCBF1 and SsCBF2 genes with the short-term treatments of NaCl， PEG， 4 ℃ and ABA

3 討論

DREB/CBF轉錄因子是植物特有的轉錄因子，目前對其家族成員的研究主要集中在 DREB1/CBF和DREB2 2個亞組［14，16］。SsCBF1和SsCBF2是從鹽地堿蓬中分離的2個DREB1/CBF同源基因，酵母單雜交試驗表明，SsCBF1和SsCBF2編碼的蛋白均能與DRE/ CRT元件特異性結合，尤其SsCBF1蛋白AP2/ERF結構域中第19位的脯氨酸并不影響其對DRE/CRT元件的特異性結合。在小麥、水稻、黑麥和大麥DREB1/CBF 的AP2/ERF結構域中也出現第19位的谷氨酸被脯氨酸取代的現象［14］。由此推測在 DREB1/CBF的 AP2/ ERF結構域中，第14位氨基酸在進化上的保守性比第19位氨基酸更強，可能對AP2/ERF與DRE/CRT的特異性結合起更重要的作用［35］。SsCBF1和SsCBF2 C末端分別含有酸性活化域“DDSDSDYE”和“DSFDDEIEAEDAD”，可能起轉錄激活功能［27，36］。

以前的研究顯示只有低溫能誘導DREB1/CBF的表達［27， 37-40］。然而，近年來的研究表明一些 DREB1/ CBF不僅能對低溫脅迫作出響應，高鹽、干旱及外源性脫落酸處理也能誘導它們的表達［41-44］。例如桉樹的EguCBF1（包括EguCBF1a、EguCBF1b和EguCBF1d）只受冷脅迫的誘導，而EguCBF1c只對鹽脅迫進行響應［45］。低溫、干旱和高鹽能誘導海欖雌AmCBF2的表達，而AmCBF1和AmCBF3的表達模式在這些環境刺激下沒有明顯的改變［46］。在本研究中，SsCBF1在鹽、PEG和低溫處理后表達量明顯升高，表明SsCBF1可能作為幾條逆境脅迫信號傳導途徑的交叉點或節點，參與鹽地堿蓬對鹽漬、干旱和低溫脅迫的網絡調控。SsCBF2在鹽和PEG處理后表達量沒有明顯變化，而低溫脅迫能顯著誘導它的表達，表明SsCBF2可能僅參與鹽地堿蓬對低溫脅迫的網絡調控，而不參與對鹽漬和干旱脅迫的響應。

植物主要通過2條途徑（依賴于ABA的調控途徑和不依賴于ABA調控途徑）調控脅迫響應基因的表達［15，47］。研究表明，無論是內源性或外源性的ABA，均參與響應于干旱、高鹽和冷脅迫的基因調控途徑［48-49］。本研究結果顯示，外源ABA處理能誘導SsCBF1的表達，表明SsCBF1通過依賴于ABA的途徑對低溫、高鹽和干旱脅迫產生響應。SsCBF2對外源ABA處理不響應，說明SsCBF2通過不依賴于ABA的途徑對低溫脅迫產生響應。SUN等［32］報道鹽地堿蓬A-6組2個DREB基因通過不依賴于ABA的途徑對對干旱和高鹽脅迫作出響應。因此，可以推斷鹽地堿蓬DREB基因家族通過依賴于ABA和不依賴于ABA 2條調控途徑對非生物脅迫產生響應。

4 結論

從鹽地堿蓬中克隆了2個DREB1/CBF同源基因SsCBF1和SsCBF2，這兩個基因編碼的蛋白均含有1個典型的AP2/ERF保守結構域，歸屬于DREB家族的 A-1組。SsCBF1與桃的 PpCBF1和楊樹的PnDREB69親緣關系最近，而 SsCBF2與馬鈴薯的StCBF3和番茄的ShCBF1親緣關系最近。SsCBF1和SsCBF2均定位于細胞核內，能與DRE/CRT元件特異性結合，并具有轉錄激活活性。在鹽地堿蓬中，SsCBF1可能通過ABA信號途徑參與對低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫的應激調控，而SsCBF2則通過不依賴于ABA的途徑對低溫脅迫產生響應。

References

［1］ SONG J， FAN H， ZHAO Y Y， JIA Y H， DU X H， WANG B S. Effect of salinity on germination， seedling emergence， seedling growth and ion accumulation of a euhalophyte Suaeda salsa in an intertidal zone and on saline inland. Aquatic Botany， 2008， 88（4）： 331-337.

［2］ 黃瑋， 李志剛， 喬海龍， 李存楨， 劉小京. 早鹽互作對鹽地堿蓬生長及其滲透調節物質的影響. 中國農業生態學報， 2008， 16（1）：173-178. HUANG W， LI Z G， QIAO H L， LI C Z， LIU X J. Interactive effect of sodium chloride and drought on growth and osmotica of Suaeda salsa. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2008， 16（1）： 173-178. （in Chinese）

［3］ SONG J. Root morphology is related to the phenotypic variation in water logging tolerance of two populations of Suaeda salsa under salinity. Plant and Soil， 2009， 324： 231-240.

［4］ SONG J， WANG B. Using euhalophytes to understand salt tolerance and to develop saline agriculture： Suaeda salsa as a promising model. Annals of Botany， 2015， 115（3）： 541-553.

［5］ 邵秋玲， 謝小丁， 張方申， 崔宏偉， 曹子誼. 鹽地堿蓬人工栽培與品系選育初報. 中國生態農業學報， 2004， 12（1）： 47-49. SHAO Q L， XIE X D， ZHANG F S， CUI H W， CAO Z Y. A preliminary study on the artificial cultivation and breeding selection of Suaeda salsa. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2004， 12（1）： 47-49.（in Chinese）

［6］ GUAN B， YU J， WANG X， FU Y， KAN X， LIN Q X， HAN G X， LU Z H. Physiological responses of halophyte Suaeda salsa to water table and salt stresses in coastal wetland of Yellow River Delta. CLEAN-Soil， Air， Water， 2011， 39（12）：1029-1035.

［7］ WANG C Q， LIU T. Involvement of betacyanin in chilling-induced photoinhibition in leaves of Suaeda salsa. Photosynthetica， 2007，45（45）： 182-188.

［8］ WANG Q， ZHOU D， WANG M， ZHAO Y， CHEN Y， YIN M， FENG X. Chemical constituents of Suaeda salsa and their cytotoxic activity. Chemistry of Natural Compounds， 2014， 50（3）： 531-533.

［9］ XU B， ZHANG M， XING C， MOTHIBE K J， ZHU C. Composition，characterisation and analysis of seed oil of Suaeda salsa L.. International Journal of Food Science & Technology， 2013， 48（4）：879-885.

［10］ ZHAO S Z， YUAN R， SUN H Z， WANG B S. Highly efficient Agrobacterium-based transformation system for callus cells of the C3 halophyte Suaeda salsa. Acta Physiologiae Plantarum， 2008， 30（5）：729-736.

［11］ 趙術珍， 阮圓， 王寶山. 鹽地堿蓬幼嫩花序的組織培養及植株再生.植物學通報， 2006， 23（1）： 52-55. ZHAO S Z， RUAN Y， WANG B S. Tissue culture and plant regeneration from immature inflorescence explants of Suaeda salsa. Chinese Bulletin of Botany， 2006， 23（1）： 52-55. （in Chinese）

［12］ QIN F， SHINOZAKI K， YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. Achievements and challenges in understanding plant abiotic stress responses and tolerance. Plant and Cell Physiology， 2011， 52（9）： 1569-1582.

［13］ NOVILLO F， MEDINA J， RODRIGUEZ-FRANCO M， NEUHAUS M， SALINAS G J. Genetic analysis reveals a complex regulatory network modulating CBF gene expression and Arabidopsis response to abiotic stress. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（1）：293-304.

［14］ AGARWAL P K， AGARWAL P， REDDY M K， SOPORY S K. Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants. Plant Cell Reports， 2006， 25（12）： 1263-1274.

［15］ YAMAGUCHI-SHINOZAKI K， SHINOZAKI K. Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses. Annual Review of Plant Biology， 2006， 57： 781-803.

［16］ LATA C， PRASAD M. Role of DREBs in regulation of abiotic stress responses in plants. Journal of Experimental Botany， 2011， 62（14）：4731-4748.

［17］ AKHTAR M， JAISWAL A， TAJ G， JAISWAL J， QURESHI M，SINGH N. DREB1/CBF transcription factors： Their structure，function and role in abiotic stress tolerance in plants. Journal of Genetics， 2012， 91（3）： 385-395.

［18］ SAKUMA Y， LIU Q， DUBOUZET J G， ABE H， SHINOZAKI K，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs， transcription factors involved in dehydration- and cold-inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2002，290（3）： 998-1009.

［19］ JAGLO K R， KLEFF S， AMUNDSEN K L， ZHANG X， HAAKE V，ZHANG J Z， DEITS T， THOMASHOW M F. Components of the Arabidopsis C-repeat/dehydration-responsive element binding factor cold response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species. Plant Physiology， 2001， 127（3）： 910-917.

［20］ CHOI D W， RODRIGUEZ E M， CLOSE T J. Barley Cbf3 gene identification， expression pattern， and map location. Plant Physiology，2002， 129（4）： 1781-1787.

［21］ DUBOUZET J G， SAKUMA Y， ITO Y， KASUGA M， DUBOUZET E G， MIURA S， SEKI M， SHINOZAKI K， YAMAGUCHISHINOZAKI K. OsDREB genes in rice， Oryza sativa L.，encode transcription activators that function in drought-， highsalt- and coldresponsive gene expression. The Plant Journal， 2003， 33（4）： 751-763.

［22］ HANG X， FOWLER S G， CHENG H， LOU Y， RHEE S Y，STOCKINGER E J， THOMASHOW M F. Freezing-sensitive tomato has a functional CBF cold response pathway， but a CBF regulon that differs from that of freezing-tolerant Arabidopsis. The Plant Jounal，2004， 39（6）： 905-919.

［23］ SHEN Y G， ZHANG W K， YAN D Q， DU B X， ZHANG J S， LIU Q，CHEN S Y. Characterization of a DRE-binding transcription factor from a halophyte Atriplex hortensis. Theoretical and Applied Genetics，2003， 107（1）： 155-161.

［24］ XIONG Y， FEI S Z. Functional and phylogenetic analysis of a DREB/CBF-like gene in perennial ryegrass （Lolium perenne L.）. Planta， 2006， 224（4）： 878-888.

［25］ CHEN M， WANG Q Y， CHENG X G， XU Z S， LI L C， YE X G， XIA L Q， MA Y Z. GmDREB2， a soybean DRE-binding transcription factor， conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2007，353（2）： 299-305.

［26］ OKAMURO J K， CASTER B， VILLARROEL R， VAN MONTAGU M， JOFUKU K D. The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997， 94（13）： 7076-7081.

［27］ LIU Q， KASUGA M， SAKUMA Y， ABE H， MIURA S，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K， SHINOZAKI K. Two transcription factors， DREB1 and DREB2， with an EREBP /AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in droughtand low-temperature-responsive gene expression， respectively， in Arabidopsis. The Plant Cell， 1998， 10（8）： 1391-1406.

［28］ 王平榮， 鄧曉建， 高曉玲， 陳靜， 萬佳， 姜華， 徐正君. DREB轉錄因子研究進展. 遺傳， 2006， 28（3）： 369-374. WANG P R， DENG X J， GAO X L， CHEN J， WAN J， JIANG H， XU Z J. Progress in the study on DREB transcription factor. Hereditas，2006， 28（3）： 369-374. （in Chinese）

［29］ 陳國強， 王萍. 鹽地堿蓬耐鹽相關基因克隆研究進展. 生物技術通報， 2008， 5： 18-21. CHEN G Q， WANG P. Research on advancement of salt tolerant genes in Suaeda salsa. Biotechnology Bulletin， 2008， 5： 18-21. （in Chinese）

［30］ PANG C H， LI K， WANG B. Overexpression of SsCHLAPXs confers protection against oxidative stress induced by high light in transgenic Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum， 2011， 143（4）： 355-366.

［31］ 劉曉雪， 孫曉波， 王秀娥， 馬鴻翔. 鹽地堿蓬SsDREB基因的克隆與表達分析研究. 核農學報， 2011， 25（4）： 684-691. LIU X X， SUN X B， WANG X E， MA H X. Cloning and expression analysis of SsDREB gene from Suaeda salsa L.. Journal of Nuclear Agricultural Sciences， 2011， 25（4）： 684-691. （in Chinese）

［32］ SUN X B， MA H X， JIA X P， CHEN Y， YE X Q. Molecular cloning and characterization of two novel DREB genes encoding dehydration-responsive element binding proteins in halophyte Suaeda salsa. Genes & Genomics， 2015， 37： 199-212.

［33］ CHEN S， SONGKUMARN P， LIU J L， WANG G L. A versatile zero background T-vector system for gene cloning and functional genomics. Plant Physiology， 2009， 150（3）： 1111-1121.

［34］ 孫曉波， 賈新平， 鄧衍明， 梁立建. 鹽地堿蓬 DREB同源基因SsDREB的功能研究. 植物遺傳資源學報， 2015， 16（3）： 624-632. SUN X B， JIA X P， DENG Y M， LIANG L J. Functional study of a DREB homologous gene SsDREB from Suaeda salsa L.. Journal of Plant Genetic Resources， 2015， 16（3）： 624-632. （in Chinese）

［35］ CAO Z F， LI J， CHEN F， LI Y Q， ZHOU H M， LIU Q. Effect of two conserved amino acid residues on DREB1A function. Biochemistry，2001， 66（6）： 623-627.

［36］ WANG Z L， AN X M， LI B， REN Y Y， JIANG X B， BO W H，ZHANG Z Y. Identification and characterization of CBF/DREB1-related genes in Populus. Forestry Studies in China， 2008， 10（3）：143-148.

［37］ GILMOUR S J， ZARKA D G， STOCKINGER E J， SALAZAR M P，HOUGHTON J M， THOMASHOW M F. Low temperature regulation of Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression. The Plant Journal，1998， 16（4）： 433-442.

［38］ WANG Y M， HE C F. Isolation and characterization of cold-induced DREB gene from Aloe vera L.. Plant Molecular Biology Reporter，2007， 25（3）： 121-132.

［39］ LIU L， CAO X L， BAI R， YAO N， LI L B， HE C F. Isolation and characterization of the cold-induced Phyllostachys edulis AP2/ERF family transcription factor， peDREB1. Plant Molecular Biology Reporter， 2011， 30（3）： 679-689.

［40］ GAO F， CHEN J M， XIONG A S， PENG R H， LIU J G， CAI B， YAO Q H. Isolation and characterization of a novel AP2/EREBP-type transcription factor OsAP211 in Oryza sativa. Biologia Plantarum，2009， 53（4）： 643-649.

［41］ JIANG F， WANG F， WU Z， LI Y， SHI G， HU J， HOU X. Components of the Arabidopsis CBF cold-response pathway are conserved in non-heading chinese cabbage. Plant Molecular Biology Reporter， 2011， 29（3）： 525-532.

［42］ YANG W， LIU X D， CHI X J， WU C A， LI Y， SONG L L， LIU X M，WANG Y F， WANG F W， ZHANG C， LIU Y， ZONG J M， LI H Y. Dwarf apple MbDREB1 enhances plant tolerance to low temperature，drought， and salt stress via both ABA-dependent and ABA-independent pathways. Planta， 2011， 233（2）： 219-229.

［43］ WANG Q， GUAN Y， WU Y， CHEN H， CHEN F， CHU C. Overexpression of a rice OsDREB1F gene increases salt， drought， and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice. Plant Molecular Biology， 2008， 67（6）： 589-602.

［44］ WANG Q J， XU K Y， TONG Z G， WANG S H， GAO Z H， ZHANG J Y， ZONG C W， QIAO Y S， ZHANG Z. Characterization of a new dehydration responsive element binding factor in central arctic cowberry. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 2010， 101（2）：211-219.

［45］ NAVARRO M， MARQUE G， AYAX C， KELLER G， BORGES J P，MARQUE C， TEULIERES C. Complementary regulation of four eucalyptus CBF genes under various cold conditions. Journal of Experimental Botany， 2009， 60（9）： 2713-2724.

［46］ PENG Y L， WANG Y S， CHENG H， SUN C C， WU P， WANG L Y，FEI J. Characterization and expression analysis of three CBF/DREB1 transcriptional factor genes from mangrove Avicennia marina. Aquatic Toxicology， 2013（140/141）： 68-76.

［47］ NAKASHIMA K， YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. Abiotic stress adaptation in plants， physiological， molecular and genomic foundation. Springer Netherlands， 2010： 199-216.

［48］ VERSLUES P E， ZHU J K. Before and beyond ABA， upstream sensing and internal signals that determine ABA accumulation and response under abiotic stress. Biochemical Society Transactions， 2005，33（Pt 2）： 375-379.

［49］ HIRAYAMA T， SHINOZAKI K. Perception and transduction of abscisic acid signals： Keys to the function of the versatile plant hormone ABA. Trends in Plant Science， 2007， 12（8）： 343-351.

（責任編輯 李莉）

Cloning and Expression Analysis of Two DREB1/CBF Genes in Suaeda salsa L.

SUN Xiao-bo， SU Jia-le， JIA Xin-ping， LIANG Li-jian， XIAO Zheng， DENG Yan-ming
（Institute of Horticulture， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement， Nanjing 210014）

Abstract：【Objective】 To provide basic information for understanding the resistant mechanism under abiotic stresses， two DREB1/CBF genes were cloned from Suaeda salsa L. At the same time， the sequence characteristics， subcellular localization and transcriptional activities of the two predicted DREB1/CBF proteins and their expression alteration in response to abiotic stress were analyzed. 【Method】The fragments of two DREB1/CBF genes were obtained by using the technique of homologous cloning. The full-length of cDNA sequences of the two DREB1/CBF genes were isolated by the method of rapid-amplification of cDNA ends （RACE）， and they were named as SsCBF1 and SsCBF2， respectively. The structures and functions of the two proteins encoded by SsCBFs were predicted by the bioinformatics software. In order to detect the subcellular localization of the two proteins， the coding sequences of the two SsCBF genes were fused， respectively， downstream to the GFP sequence to obtain two expression vectors and they were separately transferred into onion epidermal cells by the biolistic method. The binding specificity of SsCBF1 and SsCBF2to DRE/CRT cis-acting element and their transcriptional activities were investigated by using a yeast one-hybrid system. The expression of the two SsCBF genes in response to low temperature， NaCl，PEG and ABA were assessed by the real-time quantitative PCR.【Result】 SsCBF1 encoded a peptide of 225 amino acid residues with a predicted molecular mass of 25.4 kD and a pI of 4.84. SsCBF2 encoded a predicted protein of 260 amino acid residues with a predicted molecular mass of 28.6 kD and a calculated pI of 5.05. SsCBF1and SsCBF2 both contained a typical AP2/ ERF domain and shared 53.5％ and 45.4％ identity at the levels of coding nucleotides and amino acids. However， the AP2/ ERF domains of the two SsCBF genes were highly similar and shared 76.2％ and 87.3％ identity at the levels of nucleotides and amino acids， respectively. SsCBF1 and SsCBF2 were classified into A-1 subgroup of the DREB subfamily and both localized to the nucleus. The two proteins were able to specifically bind to the DRE/CRT sequence and activate the expression of the down-stream HIS reporter gene in yeast. Low temperature， drought， high salt and ABA could induce the expression of SsCBF1. However， the expression of SsCBF2 could only be induced significantly by low temperature， not by drought， high salt and ABA. 【Conclusion】 The SsCBF1 and SsCBF2 are two stress-responsive transcription factors of S. salsa. In S. salsa， SsCBF1 is involved in the stress responses of cold， high-salt and drought through ABA-dependent pathways and SsCBF2 is responsive to cold stress through ABA-independent pathway.

Key words：Suaeda salsa L.； DREB1/CBF transcription factors； subcellular localization； yeast one-hybrid； quantitative real-time PCR

收稿日期：2016-02-22；接受日期：2016-04-21

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃（2013BAD01B070403）