桑細菌性枯萎病的病原診斷與病因分析

周勤，王漢榮，謝關林，呂志強，葉偉清，梅洪飛，林寶義

（1.浙江省種植業管理局，浙江杭州 310020；2.浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州 310020；3.浙江大學生物技術研究所，浙江杭州 310020；4.浙江省農業科學院蠶桑研究所，浙江杭州 310020；5.桐廬縣農業技術推廣中心，浙江桐廬 311501；6.臨安市農技推廣中心，浙江臨安 311300）

桑細菌性枯萎病的病原診斷與病因分析

周勤1，王漢榮2，謝關林3，呂志強4，葉偉清5，梅洪飛6，林寶義1

（1.浙江省種植業管理局，浙江杭州 310020；2.浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州 310020；3.浙江大學生物技術研究所，浙江杭州 310020；4.浙江省農業科學院蠶桑研究所，浙江杭州 310020；5.桐廬縣農業技術推廣中心，浙江桐廬 311501；6.臨安市農技推廣中心，浙江臨安 311300）

本文系統介紹了發生在浙江省臨安市、桐廬縣和淳安縣的桑“枯萎”病害的癥狀，引起病害的2種病原菌“桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）”研究情況和檢測技術；通過大量的調查，系統分析了桑“枯萎”暴發的主要原因是桑樹品種抗性不強、適溫高濕環境條件、桑園農事操作和病區的砂性土壤和土壤酸化等。

桑“枯萎”；病原診斷；發病原因分析；浙江省

浙西蠶區是浙江省優質蠶繭的重點產區，其中臨安、桐廬、淳安3縣（市）的蠶繭產量約占全省蠶繭總產量的20%。2006年，臨安市和桐廬縣的部分桑園中，出現了由零星點狀的桑樹枯萎死亡到迅速擴大蔓延成片枯萎死亡的現象，發病面積達396 hm2。該病初現時，桑樹頂端葉片萎蔫，繼而葉片漸漸青枯、脫落，桑樹整株枯死；“枯萎”癥狀的桑樹莖桿外表正常，解剖觀察枝條、根系的木質部，有褐色條狀斑，嚴重的木質部褐變。蠶農經濟損失十分慘重，影響蠶桑產業的持續穩定發展。經浙江大學、浙江省農科院和浙江省農業廳等有關單位專家初步診斷為桑青枯病。桑青枯病具有發病急、蔓延快、毀滅性等特點，曾是我省檢疫性病害。該病最早于1968年在廣東省順德市發生，我省也于1992年在衢州市衢縣等地發生，對當地蠶桑生產造成了重大損失。但在隨后的調查研究中，發現桑園中還出現了與桑青枯病癥狀略有差別的枯萎癥狀，經有關專家商討后將兩種癥狀的病害統稱為桑細菌性枯萎病（下同）。2009年淳安縣也開始出現類似桑青枯病的病株。為了進一步探明3縣（市）桑園中發生的病害，研究開發有效的防控技術，2008年12月5日，浙江省農業廳和財政廳將“突發性桑樹急性枯萎病防控技術的研究與推廣”列為“2008年度省‘三農五方’科技協作計劃項目”。隨后，原浙江省農業廳經濟作物管理局（2013年起為浙江省種植業管理局）、浙江大學生物技術研究所、浙江省農業科學院蠶桑研究所和植物保護與微生物研究所、桐廬縣農業技術推廣中心和臨安市農技推廣中心組成了桑細菌性枯萎病防控技術協作攻關組，并積極爭取其他科技項目的支持，聯合開展了病原菌、檢測技術、防控技術等相關研究工作。本文主要對桑細菌性枯萎病癥狀、病原菌和發生原因進行分析。

1 病害診斷

1.1 桑細菌性枯萎病的發病癥狀

從實地調查情況看，發病桑園病株呈點、塊狀發生，有明顯的發病中心，在5月底至11月間發病嚴重。呂志強、王漢榮、周勤等［1］通過田間對桑細菌性枯萎病病株的發病癥狀進行系統觀察，并對人工接種的農桑14號（從桐廬縣和臨安市發病桑園采集和分離純化的桑細菌性枯萎病菌）發病病株進行觀察，探明了桑細菌性枯萎病發病癥狀。表明：部分幼齡桑發病初期桑樹頂端葉片在中午萎蔫，清晨與傍晚恢復正常，反復幾天后桑樹葉片漸漸青枯、脫落，甚至枯死，植株死亡速度較快，部分后期發病桑樹病葉從下而上出現枯黃并脫落現象，造成“光桿”。“枯萎”癥狀的桑樹莖桿外表正常，沒有腐爛、氣生根等現象，在田間將“枯萎”癥狀桑樹植株拔起，地下根部外表正常。解剖觀察發現：輕度“枯萎”癥狀的植株莖、枝條、根系的木質部有褐色條狀斑，嚴重的則木質部褐變。病株根及莖桿保濕培養，沒有霉狀物等產生。將“枯萎”桑樹的枝條和根進行切片鏡檢觀察，發現有明顯的噴菌現象，明確為細菌病害。

田間調查發病成林桑（3年以上），開始部分枝條中上部葉片或葉片的葉尖、葉緣失水，逐步呈青枯、褐色干枯，并擴展到全株；枝干和根部癥狀與幼林桑相同，但死亡速度較慢，部分桑樹當年恢復生長，但生長勢急速下降，第2年逐步死亡。部分桑樹夏伐后不萌發直接死亡。部分病株桑葉枯萎癥狀始于桑樹下部葉片，病葉從下而上出現枯黃并脫落現象。

1.2 桑細菌性枯萎病是由桑萎蔫病菌（Enterobac?ter mori）和勞爾氏菌（R.solanacearum）共同感染引起

1.2.1 桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）是引起桑“枯萎”的主要病原之一

浙江大學生物技術研究所王國芬等［2］從一些發病嚴重的“枯萎”病樹無法分離到桑青枯病菌，但同時分離獲得500余株細菌菌株。經細菌學、生理生化、電鏡觀察、致病性及Kock氏法則測定、Biolog鑒定、脂肪酸分析及與8株標準參考菌株的比較結果，確證其為國內外尚未報道的桑樹新病原，具有腸桿菌屬（Enterobacter）細菌的特征。在分離菌株表型鑒定與致病性測定的基礎上，浙江大學生物技術研究所朱勃等［3］通過ERIC-PCR分析及與10株參考菌株的比較、16S rRNA序列、rpoB基因分析及與Entero?bacter屬中16個與植物和環境有關種的序列比較表明，桑萎蔫病原是由Enterobacter屬1個以上的新種所引起。浙江大學生物技術研究所王國芬等［4］通過對引起“桑萎蔫”的4株菌株的Biolog、脂肪酸、16S rDNA和rpoB基因的研究，明確了該病原的特征及其多樣性。浙江大學生物技術研究所朱勃等［5］通過對桑萎蔫病菌一系列的深入研究，包括對Enterobacter屬內8個與植物有關的8個標準細菌種的分子雜交，明確了桑萎蔫病菌與國際上現有的細菌種有很大差異，將其種名定為Enterobacter mori，并得到國際認可。與此同時，浙江大學生物技術研究所朱勃等［6］深入開展桑萎蔫病菌致病基因研究，在國際上首次對引起桑萎蔫病菌的1株菌株作了全序列基因組測序。

1.2.2 勞爾氏菌（R.Solanacearum）也是引起桑“枯萎”的主要病原之一

呂志強、王漢榮、周勤等［1］對從臨安、桐廬等地桑園中的“枯萎”桑樹根、莖部獲得151個細菌分離物樣品。經離體水培接種試驗、PCR鑒定，結合田間發生癥狀，診斷為細菌性青枯病，病原為勞爾氏菌（R.so?lanacearum）。從125個雷爾氏菌株中選擇16個典型菌株進行研究，根據Hayward的生理小種劃分標準，16個分離菌株屬青枯菌生理小種1，其中75%為青枯菌的生化型V、25%為青枯菌的生化型Ⅲ。同時，從病原物分離菌株的PCR鑒定中，其中26個供試菌株沒有擴增出與番茄青枯病菌陽性對照一致的條帶，可能為一種新類型的致病菌。徐麗慧等［7］從桐廬和臨安的桑枯萎樣本中分離到病原細菌15株，經25項主要細菌學特性、菌落形態、致病性、Biolog、脂肪酸分析、RAPD-PCR鑒定及與4株標準菌株比較，證實了部分樣本中存在勞爾氏菌（R.solanacearum），屬于生化型Ⅴ和Ⅳ，它們在15株分離菌中分別占73.3%和26.7%。

1.3 桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）與勞爾氏菌（R.solanacearum）的關系

桑細菌性枯萎病是由桑青枯病菌和桑萎蔫病菌侵染桑樹維管束引起的病害，屬于一種毀滅性的桑樹細菌性病害。桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）引起的癥狀非常相似，均引起“枯萎”癥狀，這可能與這2種病原同時混合發生有一定關系。2株菌所引起的病害癥狀最大的差別是，Enterobacter mori引起的桑萎蔫，病葉容易脫落，病葉容易發黃（見圖1）。這與Enterobacter mori菌分泌的毒素有關。而R.solanacearum菌引起的“枯萎”通常是青桿上綠葉被曬干的癥狀，病葉不太容易脫落和變黃（見圖1）。2種病原菌的菌體和菌落形態相同之處是：桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）均為革蘭氏陰性菌，菌體短桿狀，能游動。在透射電子顯微鏡下觀察，兩者的差別在于：桑萎蔫病菌的個體略大于青枯病菌、周生鞭毛；青枯病菌個體略小，1～4根極生鞭毛（圖2）。它們在KMB培養基上不產生熒光色素；不產生芽孢；兼性厭氧。在TTC鑒別培養基上菌落初為紅白色，后呈半透明的深粉紅色，外圍的白色部分較小，菌落表現為：平滑，均勻，邊緣清晰、規則，紫色到深紫色菌落，外圍有一透明或半透明圈（圖3）；而桑青枯病菌（R. solanacearum）的菌落在TTC培養基上則與上述特征完全不同，菌落白色，嚴格好氧，中間呈淡紅色，邊緣不規則，流動狀。

表1 桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）的主要差別Table 1The main differences between Enterobacter mori and R.solanacearum

圖1 由Enterobacter mori引起的桑萎蔫病（左）和由R.solanacearum菌引起的桑青枯病（右）和田間癥狀Figure 1Field symptoms of mulberry wilt caused by Enterobacter mori（left）and mulberry bacterial wilt caused by R.solanacearum（right）

圖2 桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）（左）和桑青枯病菌（R.solanacearum）（右）電鏡下菌體形態Figure 2Electron microscopic morphology of mulberry wilt caused by Enterobacter mori（left）and mulberry bacterial wilt caused by R.solanacearum（right）

圖3 桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）（左）和桑青枯病菌（R.solanacearum）（右）在TTC培養基上菌落形態Figure 3Colony morphology on TTC medium of mulberry wilt caused by Enterobacter mori（left）and mulberry bacterial wilt caused by R.solanacearum（right）

2 檢測技術

由于兩種病原細菌的傳播傳染性強，桑青枯病菌為國內多省檢疫性病害，而桑萎蔫病菌在國際上尚無檢測方法。因此建立快速準確的檢測方法是控制病原傳播蔓延的有效手段之一。浙江大學生物研究所樓妙苗等［8］在國際上首次自行設計了桑萎蔫病菌Enterobacter mori的特異性引物，建立一種準確、快速、靈敏的病原實時定量PCR檢測法（靈敏度10 fg/μl和102 CFU/ml）；對桑青枯病菌R.solanacearum在國內首次設計了檢測桑青枯病菌的特異性引物，建立了簡便易行的桑青枯病病原細菌測定新方法。

浙江大學生物研究所應用自行設計的2種特異性引物和檢測技術，對田間采集樣本進行了檢測。結果顯示：引起桑萎蔫病的Enterobacter mori菌和引起桑青枯病的R.solanacearum菌可同時存在于同一樣本中，但也可單獨存在。對桐廬、臨安和淳安三地102份桑枯萎病樣本進行檢測。結果：2種菌同時存在的樣本達到53%～65%，其中以桐廬縣為最高；桑青枯病菌單獨存在的樣本占50%～55%左右，其中以淳安縣為最高（淳安縣為桑青枯病）；桑萎蔫病菌單獨存在的樣本占6%～15%，以桐廬縣為最高。表明桑萎蔫病菌在大多數情況下與桑青枯病菌同時存在，而且發現兩菌同時存在的情況下，病情相對較重。同時，對廣東地區的8份樣本桑樹疑似桑青枯病害作了比較與分析。檢測結果顯示，桑青枯病在浙江和廣東地區均較嚴重，而萎蔫病菌目前只在浙江發生，且在浙江臨安和桐廬地區發病嚴重。

3 發病原因分析

通過對桐廬、臨安和淳安等地發病桑園和病株調查，表明發病桑園除存在大量致病的桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）這個客觀原因外，經過田間調查、品種抗性試驗、土壤理化性狀分析等表明，兩種病害的發生和流行還主要與以下四個方面的原因相關。

3.1 種植的桑樹品種抗性不強

目前，桐廬、臨安和淳安三縣（市）病區種植的主要桑品種為農桑14號、荷葉白、農桑12號、桐鄉青、育711等我省現行主栽品種，其砧木為實生桑和兩廣雜交桑。經田間調查，各品種均有發生。

浙江省農科院植微所采用人工接種桑細菌性枯萎病菌（分離純化自桐廬縣的桑細菌性枯萎病株）。人工接種的菌液濃度為106～107個細菌/m1。接種方法采用斷根接種法，即用刀片將準備好的桑幼苗根部分切傷，每株灌注250 m1的細菌懸浮液。接種后每7 d調查1次，觀察28 d，最后計算累加發病株率或病情指數。病情調查分級標準：0級：無癥狀；1級：1片葉萎蔫；2級：2～3片葉萎蔫；3級：除頂部2～3片葉外，其他葉片萎蔫；4級：整株葉片萎蔫。

經人工接種鑒定強桑1號、農桑14號、金10、豐田5號、抗青10號、蘇北實生苗（CK）表明，抗青10號對桑細菌性枯萎病菌的抗性較好，其次為金10，其他桑樹品種對桑細菌性枯萎病菌的抗性均較差，結果見表2。

同時，經對我省雜交苗產地蕭山海涂苗區調查，從1997年開始從廣東大量引進對桑青枯病易感的雜交桑品種塘10×倫109［9］進行繁育，出售給桐鄉和海寧嫁接苗產區用作嫁接苗的砧木。2000年前后隨著糧食購銷市場化改革，臨安和桐廬2縣（市）開始大量種植桑樹。而從2001年和2002年即開始發病。因此，該病的發生與砧木品種塘10×倫109具有一定的相關性。

表2 不同桑品種抗細菌性枯萎病人工接種鑒定結果Table 2The evaluation results of artificial inoculation of anti-bacterial wilt among different varieties of mulberry

表3 臨安市和桐廬縣桑細菌性枯萎病發病桑園土壤情況調查Table 3The investigation of soil conditions in the mulberry orchards effected by bacterial wilt in Linan city and Tonglu county

3.2 適溫高濕環境條件有利于發病

桑青枯病菌在10～40℃的范圍內均可生長，以28～36℃生長最好，18℃以下、36℃以上生長受到抑制。因此，桑細菌性枯萎病容易在5～10月發生。種植的易感品種零星發病后，遇暴雨洪澇災害，病菌隨之擴散。分布在臨安市昌化溪、天目溪和桐廬縣分水江兩岸的桑園地勢低洼，容易遭受水淹。再遭遇間隙性雷陣雨天氣，有利于細菌的繁殖和侵染，同時桑樹葉片蒸騰作用加大，容易出現桑細菌性枯萎病大暴發。據桐廬縣氣象局提供的資料，2006年5月受北方冷空氣和第1號臺風環流的影響，出現了2次暴雨天氣，雨量偏多，月雨量達274.6 mm，較歷年偏多64%，雨量之多為歷史第三位。6月平均氣溫為25.8℃，較歷年偏高1.2℃，雖然梅雨量少，但各旬雨量分布較為均勻，由于前期雨量較多，沒有出現旱情。7月平均氣溫為29.9℃，較歷年偏高1.4℃，月雨量104.1 mm，較歷年偏少29%，月雨日14 d，較歷年偏多1 d，各旬分布均勻。8月平均氣溫為29.7℃，較歷年偏高1.8℃，氣溫之高為歷史第二位，雷暴天氣較多，達15 d，較歷年偏多5 d。因此，偏多的降水和間隙性雷陣雨天氣，成為2006年桑細菌性枯萎病大暴發之年。

3.3 桑園農事操作加劇傳播

桑苗種植后，夏季生長發育快，蒸騰作用強，但由于根部傷口較多，病菌極易侵入繁殖堵塞維管束，造成新種桑種植當年即可發病死亡。成林桑于5月下旬夏伐后，桑樹樹勢下降，大量的毛細根脫落死亡，根部形成傷口，病菌容易侵入。成林桑受到病害侵染后，可使桑樹部分枝條出現癥狀或生長勢下降，桑園中出現發病中心，第2年逐步擴展至全株發病并蔓延。同時，桑樹發病后，可通過夏伐用的桑剪、鋤頭等工具可傳播給其他桑樹，嚴重的夏伐后不萌發直接死亡；灌溉用水經過發病桑園造成水平傳播。

3.4 砂性土壤和土壤酸化有利于發病

土壤砂性重、通透性好，有利細菌的繁殖。同時，長期偏施化肥導致土壤酸化，有利于本病的發生。臨安市農技推廣中心于2011年對9個發生桑青枯病的村進行土壤調查，結果發病桑園屬砂壤土和砂土，PH值平均4.4；桐廬縣農技推廣中心對發生桑細菌性枯萎病的12個村進行土壤調查，結果桑園土壤性質屬壤土、砂土、砂壤土，土壤PH值平均6.1。2地共調查發病桑園239.2 hm2，占發病桑園的71.2%，土壤質地為砂壤土、砂土、壤土，pH值平均5.3（具體匯總數據見表3），其中屬砂壤土、砂土的面積162.32 hm2，占調查面積的67.8%。土壤調查表明，臨安市桑園土壤砂性重、土壤酸化嚴重；田間發生情況也表明，臨安市比桐廬縣發病面積廣，桐廬縣桑園發病重。

4 討論

通過多年的深入調查研究，探明了發生在浙江省臨安市和桐廬縣的桑“枯萎”是由“桑萎蔫病菌（En?terobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）”引起，其中桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）是國際上首次發現的一種新病原。由于桑萎蔫病和桑青枯病是傳播性、毀滅性病害，要有效控制病害的發生，需在明確病原種類、發病原因的基礎上，從抗病品種、防治藥劑、桑樹管理技術、土壤改良等多方面入手，形成全方位的防控技術體系。

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The Diagnosis and Analysis of the Wilt of Mulberry’s Diseases Causes

ZHOU Qin1,WANG Han-rong2,XIE Guan-lin3,LV Zhi-qiang4, YE Wei-qing5,MEI Hong-fei6,LIN Bao-yi1
（1.Zhejiang Provincial Bureau of Crop Farming,Hangzhou 310020,China; 2.The Plant Protection and Micro-organism Research Institute of Zhejiang Agricultural Science Academy,Hangzhou 310020,China; 3.The Bio-technology Research Institute of Zhejiang University,Hangzhou 310020,China; 4.The Silkworm and Mulberry Research Institute of Zhejiang Agricultural Science Academy,Hangzhou 310020,China; 5.The Agricultural Technology Extension Center of Tonglu County,Hangzhou 311501,China; 6.The Agricultural Technology Extension Center of Lin'an,Hangzhou 311300,China）

The article introduced the symptoms of wilt diseases of mulberry,as well as the study and detecting techniques of Enterobacter mori and R.solanacearum causing the diseases in Lin'an city,Tonglu county and Chun'an county in Zhejiang province systematically.Through abundant investigations,it analyzed the main causes of the outbreak of the disease systematically,mainly caused by low resistance of mulberry varieties,environmental conditions of eligible temperature and high humidity,cultivations of mulberry orchards,and the sandy and acidic soil etc.

wilt of mulberry;diagnosis of disease;analysis of disease causes;Zhejiang Province

S888.7

A

0258-4069［2016］04-012-06

周勤（1965-），女，浙江海寧人，推廣研究員，主要從事花卉、蠶桑技術推廣和行業管理。E-mail：zhq20039@163.com