小兒消化性潰瘍患者外周血單個核細胞中轉錄因子RORγt mRNA的表達

張倫敏 張倫友 劉靜

小兒消化性潰瘍患者外周血單個核細胞中轉錄因子RORγt mRNA的表達

張倫敏 張倫友 劉靜

目的 探討Th17細胞及其轉錄因子RORγt mRNA在小兒消化性潰瘍致病機制中的作用。方法 采用實時熒光定量PCR法檢測28例小兒消化性潰瘍患者和28例正常人對照組外周血單個核細胞中RORγt mRNA的表達水平。結果 小兒消化性潰瘍患者和正常人對照RORγt mRNA兩組比較差異有高度統計學意義(t＝－5.772，t＝－6.105，P＜0.001)。結論 轉錄因子RORγt高表達可能在小兒消化性潰瘍致病機制中具有重要作用。

消化性潰瘍；RORγt；外周血單個核細胞

小兒消化性潰瘍 (peptic ulcer)是指胃和十二指腸的慢性潰瘍，各年齡均可發病，病因與諸多因素有關，確切發病機制至今尚未完全闡明，目前大多數研究者認為潰瘍的形成是由于對胃和十二指腸黏膜有損害作用的侵襲因子與黏膜因素之間失去平衡的結果[1]。Th17細胞是一類新近發現的CD4+T細胞亞群，主要分泌IL-17、IL-22等細胞因子，并通過這些細胞因子發揮生物學功能，在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥等疾病的發生、發展中起重要作用。維甲酸相關孤核受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)是Th17細胞特異性轉錄因子，其水平高低可以反映Th17細胞功能狀態。本研究通過檢測小兒消化性潰瘍患者結腸組織和外周血單核細胞中Th17細胞特異性轉錄因子RORγt mRNA的表達水平，進一步探討小兒消化性潰瘍發病機制。

1 對象與方法

1.1 對象 小兒消化性潰瘍組選擇2014-01—2015-03遵義市第一醫院門診及住院確診為小兒消化性潰瘍患者28例，診斷均符合第八版人民衛生出版社兒科學診斷標準。其中，男患15例，女患13例，年齡0～6歲。對照組28例健康者，對照組與小兒消化性潰瘍組相比年齡、性別構成差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 主要試劑和儀器 淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司，RPMI-1640購自美國Sigma公司，逆轉錄試劑盒購自寶生物(大連)有限公司，實時熒光定量PCR儀購自Bioer公司。

1.3 方法 抽取小兒外周靜脈血3 mL，淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，Trizol一步法提取總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，核酸微量分析儀測其RNA的濃度及其OD值(以DEPC水調零)。反轉錄條件為：37℃ 15 min；85℃ 5 sec。RT-PCR反應條件：94℃預變性3 s，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環。循環結束后應用系統軟件繪制擴增曲線、熔解曲線。用2－△△CT法計算相對表達量，△Ct＝Ct(目的)－Ct(內參)。

1.4 PCR特異性引物 內參基因β-actin上游 ：5'-ACAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3'；下 游 ：5'-CATGCCGGAGCCGTTGTCGAC-3'，擴增產物片段長度101 bp。目的基因RORγt上游：5'-CTGCTGAGAAGGACAGGGAGCCAA-3'；下游：5'-AGGAGTAGGCCGCGTTACAGC-3'，擴增產物片段長度184 bp。所有引物均由大連寶生物有限公司合成。

1.5 統計學處理 用統計軟件SPSS 13.0統計，統計結果用(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

部分標本的PCR擴增產物(圖1)。β-actin、RORγt基因的PCR擴增產物的熔解曲線均為單峰，表明擴增產物單一，擴增曲線拐點清楚，指數期明顯，基線平，無上揚現象，說明擴增產物良好(圖2～5)。

圖1 小兒消化性潰瘍患者外周血RORγt擴增產物鑒定

圖2 β-actin擴增曲線

圖3 β-actin熔解曲線

圖4 RORγt擴增曲線

圖5 RORγt熔解曲線

小兒消化性潰瘍患者外周血PBMCs中RORγt mRNA表達水平為(5.51±4.00)，對照組為(1.11±0.51)，小兒消化性潰瘍患者外周血PBMCs中RORγt mRNA表達水平明顯高于對照組，兩者比較差異有高度統計學意義(t值=－5.763，P值＜0.001)。

3 討論

小兒消化性潰瘍是兒科消化系統的主要疾病之一，其發病率有逐年增高的趨勢，近年來小兒消化性潰瘍的臨床表現不像成人那樣典型，各種癥狀體征的發生與成人有明顯差異，潰瘍導致出血引起的癥狀也比較突出，不少患兒以貧血、面色蒼白為首發癥狀，隨著現代醫學的進步，消化性潰瘍的研究有所突破，已從傳統的實驗室檢查向分子生物學檢查邁進。

Th17細胞是近年來發現的一種CD4+T細胞亞群，是最早參與抗感染免疫的效應性T細胞，其主要分泌IL-17和IL-17F細胞因子，已有研究表明IL-17與HP感染有關，IL-17表達水平顯著高于正常對照組[2]，血清IL-17具有極強的促炎性，刺激趨化因子、炎性因子的產生，同時通過趨化因子與中性粒細胞而推動白細胞的募集，進而充分發揮炎性反應作用[3]，另外血清IL-17可以促進人體局部出現趨化因子，強化胃腸道局部炎癥的擴展[4]。RORγt是控制Thl7細胞分化的特異性轉錄因子，一方面RORγt直接誘導，促進IL-17A表達，另外一方面RORγt與活化的T細胞核因子相互作用抑制IL-2的產生，間接促進Thl7細胞的表達[5]。

目前少有轉錄調節因子RORγt與小兒消化性潰瘍發病關系的報道，本研究通過檢查小兒消化性潰瘍患者外周血中Th17細胞中RORγt mRNA表達水平，探討RORγt mRNA在小兒消化性潰瘍發病機制中的作用，實驗結果顯示小兒消化性潰瘍患者外周血中轉錄因子RORγt表達水平顯著高于正常人對照組，兩組比較差異有高度統計學意義(P＜0.001)，RORγt表達水平升高，提示Th17細胞水平增加和活性增強。RORγt的高表達可能促進了Th17細胞分化，通過調節IL-17等致炎因子的分泌參與了小兒消化性潰瘍的發生，轉錄因子RORγt可能在小兒消化性潰瘍致病機制中發揮重要作用。但是RORγt在小兒消化性潰瘍發病過程中更深層的作用及影響其轉錄因子表達因素還有待進一步研究。

[1]王衛平.兒科學[M].北京：人民衛生出版社，2015：8.

[2]陳曦.血清IL-17在消化性潰瘍的水平變化及意義[J].現代預防醫學，2012，39(7)：1756-1760.

[3]單君康.中西醫結合治療對消化性潰瘍患者血清NO、IL-17表達的影響[J].中國中醫急癥，2011，20(12)：1920-1921.

[4]李金文，劉毅，趙莉.血清IL-17在消化性潰瘍患者體內水平變化的意義[J].中國醫藥指南，2013.11(24)：130-131.

[5]王強，史洋溢，曹玫，等.Th17細胞及其特異性轉錄因子RORγt在兒童過敏性紫癜發病機制中的作用[J].中國小兒血液與腫瘤雜志，2015，4(2)：86-90.

Objective To explore the role of Th17 cell and its transcription factor of RORγt mRNA in the pathogenic mechanism of peptic ulcer in children.Methods Real-time fluorescence quantification PCR was adopted to detect the expression levels of RORγt mRNA in peripheral blood mononuclear cells among 28 children with peptic ulcer and 28 healthy controls.Results The expression level differences of RORγt mRNA in sufferers with peptic ulcer and the healthy controls were of high statistical significance(t＝－5.772，t＝－6.105，P＜0.001).Conclusion The high expression on transcription factor of RORγt mRNA may play an important role in pathogenic mechanism of peptic ulcer in children.

Peptic ulcer；RORγt；Peripheral blood mononuclear cell

2016-02-20)

1005-619X(2016)07-0734-02

10.13517/j.cnki.ccm.2016.07.028

563003 貴州省遵義市第一人民醫院