醬香大曲中產(chǎn)香細(xì)菌HMZ-D的分離鑒定及GC-MS產(chǎn)物分析

楊國(guó)華，劉洪波，周劍麗，鄒　雪，邱樹(shù)毅，黃　平，姜　螢（.貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所，貴州貴陽(yáng)550007；.貴州理工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550005；.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng)550005；.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)55005）

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醬香大曲中產(chǎn)香細(xì)菌HMZ-D的分離鑒定及GC-MS產(chǎn)物分析

楊國(guó)華1，劉洪波1，周劍麗2，鄒雪3，邱樹(shù)毅4，黃平1，姜螢1
（1.貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所，貴州貴陽(yáng)550007；2.貴州理工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550005；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng)550005；4.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

摘要：從茅臺(tái)鎮(zhèn)當(dāng)?shù)蒯u香酒廠中篩選出2種醬香高溫大曲，通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)基平板劃線分離菌株，再以聞香記錄、蛋白酶測(cè)定、發(fā)酵液酸酯分析為依據(jù)，篩選出1株放香好、蛋白酶活力高、酸酯含量較優(yōu)的菌株HMZ-D，對(duì)該菌株進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果表明，菌株HMZ-D最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適生長(zhǎng)pH值為7；菌株HMZ-D的固態(tài)、液態(tài)發(fā)酵粗酶液蛋白酶酶活具有不同的最適溫度及pH值，金屬離子對(duì)其的促進(jìn)及抑制作用也各異；HMZ-D菌株在兩種發(fā)酵方式下所得產(chǎn)物種類(lèi)較為相似，但液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)各化合物含量及各類(lèi)物質(zhì)總量要低于固態(tài)發(fā)酵，從含量上看具有一系列主要特征性產(chǎn)物；通過(guò)鑒定，菌株HMZ-D歸屬為巨大芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：微生物；醬香大曲；產(chǎn)香細(xì)菌；分離篩選；鑒定；GC-MS分析

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1448.016.html。

醬香型白酒素以“微黃透明、醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體醇厚、回味悠長(zhǎng)、空杯留香持久”的特點(diǎn)而馳名中外。20世紀(jì)60年代起，我國(guó)的科研工作者們就開(kāi)始對(duì)醬香型白酒的典型代表——茅臺(tái)酒的各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)進(jìn)行研究，以期找到其經(jīng)驗(yàn)式的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝與生物、化學(xué)、物理等多門(mén)科學(xué)之間的深層聯(lián)系。這一方面可為我國(guó)傳統(tǒng)白酒打下堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)，另一方面也可利用科技指導(dǎo)生產(chǎn)，為行業(yè)內(nèi)的創(chuàng)新技術(shù)能夠成功實(shí)踐鋪平道路。

本課題組從醬香大曲中分離篩選產(chǎn)醬香菌株，并進(jìn)行相關(guān)研究，已取得一定研究成果［1-2］。現(xiàn)從菌株的分離篩選、鑒定、GC-MS產(chǎn)物含量分析的角度來(lái)詳細(xì)介紹整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，以期為相關(guān)研究的開(kāi)展提供參考與借鑒。

1材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

1.1.1菌種分離材料

本研究實(shí)驗(yàn)所用菌株分離材料——醬香高溫大曲是在仁懷茅臺(tái)鎮(zhèn)2家醬香酒生產(chǎn)企業(yè)的種曲車(chē)間選取的，選擇標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1實(shí)驗(yàn)大曲選擇標(biāo)準(zhǔn)

按上述標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)對(duì)應(yīng)廠家日常理化指標(biāo)鑒定結(jié)果，得到代號(hào)分別為HMZ、GZL的2種高溫大曲。將曲樣用封口膠袋密封，保存于4℃的冰箱中備用，另外，為使在室內(nèi)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果盡可能與實(shí)際生產(chǎn)相符合，所用高粱、小麥、麩皮皆為廠家提供。

培養(yǎng)基：平板分離培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按參考文獻(xiàn)［1］、［2］中的方法進(jìn)行配制［1-2］。

1.1.2試劑

實(shí)驗(yàn)試劑按表2所示進(jìn)行準(zhǔn)備。

1.1.3儀器設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)所需儀器設(shè)備見(jiàn)表3。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1產(chǎn)醬香細(xì)菌的分離篩選

初篩：將挑選的HMZ、GZL 2種大曲分別粉碎成粉末狀，于無(wú)菌水中混勻，30℃水浴中活化30min，取出；按梯度稀釋涂布劃線法進(jìn)行菌株的篩選，挑取形態(tài)有差異的單菌落于斜面試管上以37℃培養(yǎng)24h，編號(hào)，4℃保藏；將各所得試管菌株接入液態(tài)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h得到各菌的液態(tài)培養(yǎng)液；將其各自按10%接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，培養(yǎng)方式為37℃恒溫培養(yǎng)，每天取出，聞香，記錄每天的香味變化情況，綜合選出感官評(píng)價(jià)較高的菌株。

表2主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥品

復(fù)篩：根據(jù)聞香、蛋白酶活力，結(jié)合固態(tài)發(fā)酵酸酯含量測(cè)定結(jié)果，篩選出1株香味佳、酶活高、酸酯含量較高的菌株。

1.2.2發(fā)酵粗酶液的制備［3］

固態(tài)發(fā)酵粗酶液制取（5%酶液）：稱(chēng)取發(fā)酵醅1 g于20mL醋酸鈉溶液中。40℃水浴浸出30min，4000r/min離心，濾紙過(guò)濾，即為所得酶液（每株菌做3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值）。

表3主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

表4 37℃下聞香結(jié)果

液態(tài)發(fā)酵粗酶液制取（5%酶液）：將10%接種量的液體發(fā)酵培養(yǎng)基以200r/min培養(yǎng)，各取2d、4d、6d發(fā)酵液，4000r/min離心10min后，取上清液即是所需的粗酶液，于4℃冰箱中保存待用（每株菌做3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值）。

1.2.3測(cè)定方法

根據(jù)參考文獻(xiàn)［2］及《釀酒分析與檢測(cè)》［3］的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)發(fā)酵粗酶液的蛋白酶、總酸、總酯等進(jìn)行測(cè)定。1.2.4目標(biāo)菌株的鑒定

1.2.4.1不同溫度、pH值下生長(zhǎng)曲線繪制

溫度：將HMZ-D菌株接入液體培養(yǎng)基中，選取培養(yǎng)溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，使用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)520nm）測(cè)定培養(yǎng)液的OD值，每隔2h測(cè)1次直至60h為止；以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

pH值：將所HMZ-D菌株接入液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH值分別為5、6、7、8、9，使用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)520nm）測(cè)定培養(yǎng)液的OD值，每隔2h測(cè)1次直至60h為止；以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4.2顯微形態(tài)觀察

采用稀釋涂布平板法對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，再依據(jù)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》［9］作革蘭氏染色及芽孢染色，以便在顯微鏡下觀察其形態(tài)。

1.2.4.3生理生化實(shí)驗(yàn)

按《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［4］及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［5］對(duì)目標(biāo)菌作生理生化鑒定，分別考察了其革蘭氏染色、觸酶、VP反應(yīng)等14個(gè)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.4分子生物學(xué)水平鑒定

由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.5粗酶液酶活變化研究

對(duì)目標(biāo)菌株在1.2.2方法下所制得純種發(fā)酵粗酶液，在不同溫度、pH值、乙醇濃度、金屬離子下的變化進(jìn)行了研究，并且對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了分析測(cè)定。

1.2.6 GC-MS產(chǎn)物分析

參考文獻(xiàn)按［2］、［6］中方法進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1菌株分離篩選

2.1.1發(fā)酵聞香結(jié)果

從HMZ與GZL兩個(gè)大曲中共分離出21株菌株，轉(zhuǎn)于斜面培養(yǎng)基中4℃下保存。通過(guò)模擬固態(tài)發(fā)酵感官聞香比較，選出8株產(chǎn)醬香較明顯菌株，對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，聞香結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4結(jié)果來(lái)看，在37℃的較高溫度下，8株菌種中大多數(shù)都能產(chǎn)生較易辨別的醬香味，而且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，醬香味更濃，其他的邪雜、異味也逐漸消退。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)來(lái)看，在“高溫堆積”的過(guò)程中發(fā)酵時(shí)間往往不是固定的，短則只要3～4d，多則7～8d。這和四季變更及當(dāng)?shù)貧夂蜃兓泻艽蟮年P(guān)系。一般情況下，蒸好的糧食經(jīng)攤晾、拌曲，再掀蓋成堆子，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，拌入曲子和周?chē)h(huán)境中所富集的微生物會(huì)大量進(jìn)行繁殖代謝生長(zhǎng)，在生成很多香味前體物質(zhì)的同時(shí)也釋放出熱量，這樣就會(huì)使得堆子內(nèi)部溫度升高。一般車(chē)間實(shí)際生產(chǎn)會(huì)根據(jù)相關(guān)的指標(biāo)來(lái)判斷是否到了該下窖的時(shí)候，如手感、氣味、溫度等，只要達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)即可下窖。在以上聞香結(jié)果中，多數(shù)菌株都有醬香味，但味道有明顯的區(qū)別，有些醬香風(fēng)味淡寡，且還有異味；有些較為醇厚、純正，且風(fēng)味上佳，使人愉悅。

2.1.2菌株發(fā)酵測(cè)定分析

2.1.2.1蛋白酶測(cè)定

按1.2.4方法對(duì)初篩所選的8株產(chǎn)醬香菌株的蛋白酶進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，HMZ-D的蛋白酶活力明顯高于其余菌株。因醬香酒在貯存的過(guò)程中其酸酯含量較多，且酯含量大于酸，下一步根據(jù)以上各菌株產(chǎn)香情況和蛋白酶活力的高低，選出3株菌：HMZ-D、GZL-Y、GZL-Z，作發(fā)酵清液的酸酯含量測(cè)定。

2.1.2.2總酸、總酯測(cè)定

根據(jù)1.2.4的方法取與蛋白酶測(cè)定時(shí)一樣的發(fā)酵時(shí)間，測(cè)定發(fā)酵清液的酸酯含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 3株菌發(fā)酵清液酸酯含量測(cè)定　（g/L）

從表5結(jié)果來(lái)看，HMZ-D的蛋白酶活力最高，對(duì)應(yīng)的總酸、總酯含量也明顯高于GZL-Y、GZL-Z；3株菌的酸酯含量皆隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，這表明所接菌種對(duì)發(fā)酵醅起到明顯的分解代謝作用；GZL-Y、GZL-Z 2株菌的蛋白酶活力稍低，而對(duì)應(yīng)的酸酯含量也較低。結(jié)合此3株菌的感官聞香、酶活力測(cè)定、酸酯含量推斷：所分離篩選出的細(xì)菌蛋白酶活力較高，對(duì)應(yīng)的酸酯含量也較高，而后者又是白酒中主要香味成分，所以從菌株產(chǎn)蛋白酶作用原料方面入手來(lái)研究醬香的主體風(fēng)味物質(zhì)具有一定的可行性。

綜合以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選定HMZ-D為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究目標(biāo)菌株。

2.2HMZ-D發(fā)酵粗酶液酶活變化研究

2.2.1溫度

在按1.2.2方法得到粗酶液后，選取25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃水浴溫度對(duì)酶液活化5min，而后測(cè)定其酶活（圖2）。

圖2酶活隨溫度變化

由圖2可知，2種方式發(fā)酵下的酶活在35～40℃之間有最大值，其最適酶活溫度也在此范圍。另外，高溫所導(dǎo)致的酶失活程度明顯高于低溫下，這實(shí)際上是一個(gè)物理化學(xué)現(xiàn)象：高溫意味著劇烈的熱運(yùn)動(dòng)，低溫反之；熱運(yùn)動(dòng)過(guò)強(qiáng)就會(huì)破壞分子結(jié)構(gòu)，對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，也就是失去了活性的基礎(chǔ)。低溫不破壞蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)并不能讓蛋白質(zhì)失活，而是通過(guò)降低熱運(yùn)動(dòng)來(lái)減緩反應(yīng)速率，不僅是對(duì)于酶，有些物化、生化反應(yīng)也是如此。

2.2.2 pH值

取pH值為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的乳酸-乳酸鈉緩沖液配制的20 g/L酪蛋白作為底物，以此測(cè)定液態(tài)發(fā)酵蛋白酶；對(duì)于固態(tài)發(fā)酵醅，則用以上緩沖液進(jìn)行提取測(cè)定（圖3）。

圖3酶活隨pH值變化

由圖3可知，在酸性條件下，固液酶活都較高，初步說(shuō)明此蛋白酶是酸性酶。其中固、液酶活最適pH值分別為4、4.5；并不是酸度越高就越適于酶活升高，相反當(dāng)體系的pH值開(kāi)始降低至2.5時(shí)，酶活力有明顯的下降，同時(shí)在pH值靠近中性時(shí)，酶活力也會(huì)下降。pH值過(guò)高或過(guò)低一方面會(huì)改變酶的構(gòu)象致使其失活，一方面也會(huì)影響底物分解及其與酶的結(jié)合能力，從而導(dǎo)致活力降低［10］。

2.2.3乙醇濃度

選用無(wú)水乙醇（分析純），用蒸餾水配制3%vol、3.5%vol、4.0%vol、4.5%vol、5.0%vol、5.5%vol、6.0%vol的乙醇-水溶液替代緩沖液對(duì)發(fā)酵醅進(jìn)行酶液提取；對(duì)于液態(tài)發(fā)酵酶液則直接按體積比向酶液中添加乙醇，以此測(cè)定（圖4）。

圖4酶活隨乙醇濃度變化

由圖4可看出，2種發(fā)酵狀態(tài)的酶活皆隨著乙醇濃度的提升而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在達(dá)到一定值（4.5%vol）時(shí)趨于平穩(wěn)。總體來(lái)說(shuō)，乙醇的加入對(duì)酶活起到抑制作用。

2.2.4熱穩(wěn)定性

將所得酶液置于80℃高溫下，對(duì)于固態(tài)（發(fā)酵醅先經(jīng)保溫處理再提粗酶液）、液態(tài)分別選取不同的保溫時(shí)間（固態(tài)：1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min；液態(tài)：10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80、90s）對(duì)酶活進(jìn)行測(cè)定，其中對(duì)液態(tài)發(fā)酵的測(cè)定是以80℃水浴保溫處理。以不經(jīng)保溫的為對(duì)照，考察其在高溫下隨時(shí)間的酶穩(wěn)定性，結(jié)果以與未熱處理的對(duì)照相比所得的酶活降低百分?jǐn)?shù)表示，見(jiàn)圖5。

圖5 80℃下粗酶液發(fā)酵酶活熱穩(wěn)定變化曲線

由圖5看出，在80℃下，酶迅速失活，最低可達(dá)到初始酶活的25%左右。其中，液態(tài)酶活下降速率明顯遠(yuǎn)高于固態(tài)，可能是由于水浴加熱導(dǎo)致體系更容易接收熱量，使酶受到高熱的作用而迅速失活。

2.2.5金屬離子

配制1.5 mmol/L的KCl、CaCl2、FeCl3、MgSO4、Zn-SO4、CuSO4溶液對(duì)發(fā)酵醅進(jìn)行提取粗酶液，測(cè)定；對(duì)于液態(tài)發(fā)酵酶液，則直接按此濃度添加藥品，再測(cè)定。以未添加藥品的為對(duì)照，以與其相比所得的升降百分?jǐn)?shù)表示（圖6）。

圖6金屬離子對(duì)酶活的影響

由圖6可知，不同金屬離子對(duì)酶活有不同的明顯作用：Fe2+、Fe3+、Mg2+、Zn2+對(duì)2種發(fā)酵酶活皆有明顯的抑制作用，其中Zn2 +的作用最為明顯（固態(tài)-32%、液態(tài)-20%）；K+、Cu2+、Mn2+、Ca2+同時(shí)都能促進(jìn)固液酶活，其中Mn2+效果最為明顯（固+23%、液+12%）。

2.3菌株HMZ-D的鑒定

2.3.1不同溫度、pH值下生長(zhǎng)曲線繪制

2.3.1.1溫度

將HMZ-D菌株接入液體培養(yǎng)基中，選取培養(yǎng)溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，使用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)520nm）測(cè)定培養(yǎng)液的OD值，每隔2h測(cè)1次直至60h為止；以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 HMZ-D不同溫度生長(zhǎng)曲線

由圖7可知，60℃下菌株幾乎不生長(zhǎng)，表明此溫度過(guò)高，對(duì)菌株具有抑制甚至是殺滅作用；在30℃下，菌株生長(zhǎng)最好；而在40℃及50℃下，菌株的生長(zhǎng)較好。并且從圖7中可以看出，30℃及50℃下菌株處在穩(wěn)定期的時(shí)間較長(zhǎng)。

2.3.1.2 pH值生長(zhǎng)曲線

將HMZ-D菌株接入液體培養(yǎng)基中，選取培養(yǎng)pH值分別為5、6、7、8、9，使用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)520nm）測(cè)定培養(yǎng)液的OD值，每隔2h測(cè)1次直至60h為止；以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 HMZ-D菌株的不同pH值生長(zhǎng)曲線

由圖8可知，HMZ-D在中性條件（pH7）條件下生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)最佳；而在偏酸或偏堿的環(huán)境中，其生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。

2.3.2顯微形態(tài)觀察

按1.2.4.2方法，在顯微鏡下對(duì)HMZ-D形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 HMZ-D顯微形態(tài)察結(jié)果

由圖9可知，HMZ-D在細(xì)菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，其單菌落呈類(lèi)圓狀，較黏稠平滑、易挑起；革蘭氏染色為陽(yáng)性，呈桿狀，長(zhǎng)度約為2.0μm；取37℃下培養(yǎng)12h的斜面菌體進(jìn)行芽孢染色，顯微觀察可看到許多綠色芽孢，菌體則為紅色。

2.3.3生理生化指標(biāo)測(cè)定

按1.2.4.3方法，HMZ-D生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6生理生化鑒定結(jié)果

2.3.4分子生物學(xué)水平鑒定

得到的基因組電泳圖及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜見(jiàn)圖10。

所用到的引物序列：

8f（5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3'）；1492r （5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

圖10 HMZ-D基因組電泳圖及PCR擴(kuò)增電泳圖

由圖10可知，所提取的總基因組大小為10000 bp左右；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為1000 bp左右。通過(guò)膠回收試驗(yàn)對(duì)目的DNA進(jìn)行純化，上機(jī)測(cè)序；將得到的16s rDNA序列輸入NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖11。

圖11系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

綜合以上顯微形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果，將HMZ-D鑒定為巨大芽孢桿菌。查閱相關(guān)資料，目前在醬香功能細(xì)菌的研究中鮮有關(guān)于巨大芽孢桿菌的報(bào)道。因此，繼續(xù)對(duì)此菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行GCMS分析，以期找到與其他相關(guān)報(bào)道具有共性的地方，以及對(duì)此“新種”對(duì)醬香風(fēng)味的形成所起作用進(jìn)行探討分析。

2.4GC-MS產(chǎn)物分析

2.4.1產(chǎn)物列表

對(duì)各個(gè)化合物含量情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)表7、表8。

由表7、表8結(jié)果可知，30℃及37℃2種溫度條件下對(duì)其2種培養(yǎng)方式的發(fā)酵產(chǎn)物作GC-MS分析。結(jié)果表明，HMZ-D菌株2種發(fā)酵方式下所得種類(lèi)較為相似，但液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)各化合物含量及各類(lèi)物質(zhì)總量要低于固態(tài)發(fā)酵，且在37℃下，固液發(fā)酵所得產(chǎn)物的含量均比低溫（30℃）明顯提高，其中以正辛酸、丁酸乙酯、己酸乙酯、丙酸辛酯、癸醛的含量升高明顯；少數(shù)物質(zhì)含量在30℃時(shí)反而較高，如2，5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪。正辛醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、己酸丁酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、乙酸、癸酸、2，5-二甲基吡嗪及四甲基吡嗪為HMZ-D發(fā)酵主要特征產(chǎn)物，初步推斷巨大芽孢桿菌對(duì)醬香風(fēng)味的形成也起著重要的作用。具體分析見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］。

2.4.2圖譜分析

按1.2.6方法進(jìn)行產(chǎn)物分析，對(duì)30℃、37℃下HMZD固態(tài)、液態(tài)發(fā)酵所得產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析，本節(jié)內(nèi)容已在參考文獻(xiàn)［2］中進(jìn)行了大類(lèi)上的分析，現(xiàn)將各檢測(cè)物含量進(jìn)行列表分析，以便更準(zhǔn)確地分析各單體物質(zhì)的變化。GC-MS圖譜見(jiàn)圖12。

由圖12可知，以菌株HMZ-D進(jìn)行固、液發(fā)酵可明顯產(chǎn)生多種物質(zhì)，從圖譜所體現(xiàn)的直觀信息看，37℃下發(fā)酵所得峰型較多。以所測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物作定性及定量分析。

表7 HMZ-D固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物含量分析

3　結(jié)論

3.1以醬香大曲為菌株篩選源，利用蛋白胨細(xì)菌培養(yǎng)基通過(guò)稀釋涂布及劃線涂布篩選得到21株不同菌落形態(tài)菌株。從此21株菌中，以感官聞香為初篩指標(biāo)，得到3株產(chǎn)醬香明顯的菌株，再以蛋白酶活力及酸酯測(cè)定結(jié)果為指標(biāo)，最終篩選出1株產(chǎn)香好、酶活高的菌株（HMZ-D）。

3.2繪制菌株HMZ-D生長(zhǎng)溫度及pH值曲線，得到其最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適生長(zhǎng)pH值為7；然后對(duì)其進(jìn)行鑒定，通過(guò)形態(tài)、生理生化、分子水平鑒定最終將HMZD歸屬為巨大芽孢桿菌。

3.3對(duì)HMZ-D固、液發(fā)酵粗酶液酶活變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明：（1）兩種條件下所得粗酶液酶活隨溫度均呈先升高后降低的趨勢(shì)；（2）隨pH值變化均呈先升后降趨勢(shì)，但幅度不大；（3）兩種發(fā)酵狀態(tài)的酶活皆隨著乙醇濃度的提升而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在達(dá)到一定值（4.5%）時(shí)趨于平穩(wěn)；（4）在80℃下兩種條件下發(fā)酵粗酶液酶活均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，最低可降至25%，且液態(tài)發(fā)酵酶活降低速率較快；（5）金屬離子Fe2+、Fe3+、Mg2+、Zn2+對(duì)兩種發(fā)酵酶活皆有明顯的抑制作用，其中Zn2+的作用最為明顯；K+、Cu2+、Mn2+、Ca2+同時(shí)都能促進(jìn)固液酶活，其中以Mn2+的促進(jìn)作用最為明顯。

表8 HMZ-D液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物含量分析

3.4在化合物含量上，固態(tài)發(fā)酵明顯多于液態(tài)發(fā)酵，且2種發(fā)酵方式在高溫下很多醇、酯、醛、其他芳香及雜環(huán)化合物含量增幅明顯，這表明本研究的目標(biāo)菌株HMZ-D發(fā)酵可產(chǎn)生較多的發(fā)酵風(fēng)味產(chǎn)物；正辛醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、己酸丁酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、乙酸、癸酸、2，5-二甲基吡嗪及四甲基吡嗪為HMZ-D發(fā)酵的主要特征產(chǎn)物。

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圖12 GC-MS分析圖譜

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Isolation & Identification of Aroma-Producing Bacteria Strain HMZ-D from Jiangxiang Daqu and GC-MS Analysis of Its Metabolites

YANG Guohua1，LIU Hongbo1，ZHOU Jianli2，ZOU Xue3，QIU Shuyi4，HUANG Ping1and JIANG Ying1
（1.Guizhou Institute of Light Industry，Guiyang，Guizhou 550007；2.Guizhou Institute of Technology，Guiyang，Guizhou 550005；3.Affiliated Hospital of Guizhou Medcial University，Guiyang，Guizhou 550005；4.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract:Two kinds of Jiangxiang high-temperature Daqu were screened form local distilleries in Maotai town.Then bacteria strains were isolated from Daqu through bacteria culture medium flat line isolation.With aroma records，protease detection，and acid & ester analysis of fermenting liquid，a bacteria strain HMZ-D with good aroma-producing capacity，high protease activity，and good ester & acid content was finally obtained.The relative experimental analysis suggested that，the optimum growth temperature of HMZ-D was 30℃and its optimum growth pH value was 7；crude enzyme liquid protease activity by solid fermentation/liquid fermentation of HMZ-D had different optimum temperature and pH value，and the promoting effects/inhibiting effects of metal ions were different；HMZ-D strain had almost the same metabolites under two different fermentation patterns，however，the content of each compound produced in liquid fermentation and the total amount of the produced compounds were lower than that in solid fermentation；strain HMZ-D was identified as Bacillus megaterium.

Key words:microbe；Jiangxiang Daqu；aroma-producing bacteria；isolation & screening；identification；GC - MS analysis

中圖分類(lèi)號(hào)：TS261.1；Q93-3；TS262.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）06-0029-09

DOI：10.13746/j.njkj.2016139

基金項(xiàng)目：貴州科學(xué)院青年基金，編號(hào)：黔科院J合字［2014］09號(hào)。

收稿日期：2016-04-20

作者簡(jiǎn)介：楊國(guó)華（1987-），男，碩士研究生，工程師，國(guó)家二級(jí)品酒師，主要從事科技期刊編輯、釀酒微生物等方面科研工作。

通訊作者：邱樹(shù)毅，博士，教授，博士生導(dǎo)師。