巨峰葡萄酵母菌的分離及耐受性研究

賈春鳳，曹柳青，馬愛進(jìn)（.河北保定學(xué)院，河北保定07000；.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京00088）

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巨峰葡萄酵母菌的分離及耐受性研究

賈春鳳1，曹柳青1，馬愛進(jìn)2
（1.河北保定學(xué)院，河北保定071000；2.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京100088）

摘要：發(fā)酵菌株直接影響著葡萄酒的品質(zhì)。我國巨峰葡萄資源豐富，常被人們用來自釀葡萄酒，但專用發(fā)酵菌株卻鮮見報(bào)道，主要分離巨峰葡萄酒專用發(fā)酵菌株并對(duì)其進(jìn)行初步研究。采用傳統(tǒng)的微生物分離手段從巨峰葡萄自然發(fā)酵過程分離菌100株，經(jīng)初步分析后，獲得典型的3類酵母菌，共9株。以自然發(fā)酵為對(duì)照，和安琪酵母作比較，新分離菌株對(duì)葡萄糖的利用趨勢(shì)相同，并且發(fā)酵能力較強(qiáng)。以安琪酵母為對(duì)照，對(duì)9株菌進(jìn)行耐糖性、耐酸性、耐較高酒精度試驗(yàn)，得出耐性最好的菌株為A1、A5、C3。

關(guān)鍵詞：巨峰葡萄；酵母菌；分離；耐受性

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1609.019.html。

由于巨峰葡萄具有明顯的大穗、大粒、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)［1］，自20世紀(jì)60年代引入后，便在我國廣泛培植。在我國現(xiàn)有葡萄品種中，其栽培面積超過其他任何品種，產(chǎn)量高，遙居全國之首［2］。巨峰葡萄還含還有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)以及多種維生素，營養(yǎng)豐富。隨著人們生活水平的提高，具有保健功能的葡萄酒倍受人們喜愛［3］，葡萄酒的自釀逐漸被人們追捧，巨峰葡萄已成為人們自釀葡萄酒的首選原料。由于不同品種葡萄自身所帶發(fā)酵菌株不同，不同發(fā)酵菌株發(fā)酵產(chǎn)物不同，目前專門用于巨峰葡萄酒發(fā)酵的菌種鮮有報(bào)道［4-6］。本研究主要對(duì)巨峰葡萄酵母菌進(jìn)行了分離，并對(duì)其耐受性進(jìn)行了初步研究，為之后不同品種優(yōu)良菌種的探索提供參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

巨峰葡萄，購于河北省保定市市場(chǎng)；安琪酵母，安琪酵母有限公司；葡萄糖，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；瓊脂，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

儀器設(shè)備：電子天平JA2002，上海精天電子儀器有限公司；手提式電熱壓力消毒器YXQG02，山東安得醫(yī)療科技有限公司；超凈工作臺(tái)SW-CJ-2F，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱svp-01，湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；微量移液器，上海求精生化試劑儀器有限公司；測(cè)糖儀，上海天皇儀器儀表有限公司；熒光顯微鏡BX51 OLYMPUS，奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社。

1.2培養(yǎng)基的配制［7］

酵母菌分離培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%；溶于1 L蒸餾水中，可另加100 mg/L的氯霉素抑制細(xì)菌繁殖。115℃滅菌30min。

酵母菌保存培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%；溶于1 L蒸餾水中，115℃滅菌30min。

耐高糖試驗(yàn)培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，不同濃度葡萄糖（100 g、200 g 300 g、400 g 500 g），20 g瓊脂，溶于1 L蒸餾水中，115℃滅菌30min。

耐高酸試驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，不同pH值（pH值分別為1、2、3、4、5、6），溶于1 L蒸餾水中，115℃滅菌30min。

耐酒精試驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，不同濃度乙醇（0、6%vol、9%vol、12%vol、15%vol、18%vol），溶于1 L蒸餾水中，115℃滅菌30min。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1葡萄酵母菌種的分離

葡萄酒的發(fā)酵［8-9］：使用分析天平稱取3份巨峰葡萄，每份160 g。將葡萄去梗，在水中浸泡30min，瀝干。根據(jù)葡萄∶葡萄糖=8∶1的比例，使用電子天平稱取3份葡萄糖，在超凈工作臺(tái)中，將葡萄捏碎至250mL錐形瓶中，加入葡萄糖。搖晃均勻，加塞，并用保鮮膜包扎密封。將3支錐形瓶放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵釀造。

葡萄酵母的分離：每天分別從3個(gè)錐形瓶中取出樣品0.5mL，用生理鹽水稀釋樣品、振蕩，至預(yù)設(shè)范圍。在選取的3個(gè)稀釋度中分別取0.1mL放入培養(yǎng)皿中，倒入酵母菌分離培養(yǎng)基，混菌培養(yǎng)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，分別進(jìn)行標(biāo)記，放入設(shè)定溫度為28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h。然后，分別觀察酵母菌菌落形態(tài)，區(qū)分不同種類的酵母菌，挑取代表性菌落、劃線分離，初步顯微鏡鑒定。并記錄新種類酵母菌出現(xiàn)時(shí)的發(fā)酵時(shí)間。將出現(xiàn)的不同種類的酵母菌在試管斜面上劃線保存，做好標(biāo)記，備用。

1.3.2新分離菌種發(fā)酵葡萄糖試驗(yàn)

菌種的活化：將少量安琪酵母顆粒溶于YPD液體培養(yǎng)基的試管中，加塞，包扎。放置于設(shè)定溫度為28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，挑取培養(yǎng)液至斜面試管中劃線、培養(yǎng)、保存?zhèn)溆谩⒋郎y(cè)菌株和斜面安琪酵母接種于YPD斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1～2d，挑取1環(huán)菌苔接入無菌水中，混勻成菌懸液，并使其菌含量相等，待用。

按1.3.1稱量葡萄和葡萄糖9份，分別放入錐形瓶中。在此次釀造過程中，將分離出的酵母菌根據(jù)其在發(fā)酵過程中出現(xiàn)的時(shí)間，于相對(duì)應(yīng)發(fā)酵時(shí)間，加入以上活化菌種溶液1mL，標(biāo)號(hào)為1，共做3個(gè)平行。同時(shí)在標(biāo)號(hào)為2的3個(gè)樣品中分別加入與1號(hào)樣品相同濃度的活化的安琪酵母溶液1mL作為對(duì)照。在3個(gè)3號(hào)樣品中只需加入總量相同的培養(yǎng)液為對(duì)照。將9支錐形瓶放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵釀造。每天用手持測(cè)糖儀［10］測(cè)定發(fā)酵液中的糖含量，至糖含量基本不變?yōu)橹埂?/p>

1.3.3新分離菌種耐受性試驗(yàn)

將1.3.2中已活化好的菌種分別等量接入耐高糖試驗(yàn)培養(yǎng)基、耐酸試驗(yàn)培養(yǎng)基、耐酒精試驗(yàn)培養(yǎng)基中，根據(jù)薛波［11］的方法，參考劉向勇［12］、吳帥［13］、薛軍俠［14］等人的試驗(yàn)進(jìn)行新分離菌種耐受高糖、耐酸和耐酒精性測(cè)定。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

1.4數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，用excel處理數(shù)據(jù)，最后取用平均值表示。用Sigmaplot 10.0和excel作圖。

2結(jié)果與分析

2.1酵母菌的初步分離

通過每天對(duì)巨峰葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌的分離、初步鑒定和總結(jié)，結(jié)果見表1。

表1分離出的代表菌種

本部分試驗(yàn)，共分離酵母15d，當(dāng)自然發(fā)酵到第10天時(shí)，發(fā)酵液中的菌含量和種類已經(jīng)基本趨于穩(wěn)定。取前10d分離酵母菌100株，進(jìn)行初步鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)10d中，典型酵母菌株共3種。第1種如表1所示，代表字母為A，保存代表菌株分別為第1天分離所得A1、第5天分離所得A5、第10天分離所得A10。第2種和第3種都是從第3天開始出現(xiàn)的，第2種代表字母為B，保存菌種分別為第3天分離所得B3、第7天分離所得B7、第10天分離所得B10。第3種代表字母為C，保存菌種分別為第3天分離所得C3、第7天分離所得C7、第10天分離所得C10。最終分離獲得代表性菌株9株。

2.2新分離菌種發(fā)酵葡萄糖能力測(cè)定

從圖1可以看出，在28℃恒溫培養(yǎng)下每個(gè)樣品的糖度都一直處于下降狀態(tài)，說明在發(fā)酵過程中，酵母菌將樣品中的葡萄糖轉(zhuǎn)化成酒精。其化學(xué)反應(yīng)方程式為：

C6H12O6→2CH3COCOOH+4H+→2CH3CHOHCOOH+能量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)樣品的下降趨勢(shì)大致相同，在發(fā)酵前7d，糖度下降速度較快，并且1號(hào)樣品中糖的下降幅度稍大一些。可見，加入新分離酵母菌后，可加速巨峰葡萄酒的發(fā)酵，比加入等量的安琪酵母發(fā)酵能力強(qiáng)。

圖1分離時(shí)期葡萄糖發(fā)酵液糖濃度變化圖

2.3新分離菌種耐受性測(cè)定

2.3.1液態(tài)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將酵母菌活化以后制成菌液，將菌液濃度分別稀釋為20%、40%、60%、80%、100%，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD值，分別為0.307、0.724、0.833、1.181、1.435，并將菌液稀釋倒平板得知100%的菌液對(duì)應(yīng)的菌濃度為1.66×107cfu/mL，根據(jù)以上數(shù)據(jù)繪制出以菌液OD值為橫坐標(biāo)，以菌濃度為縱坐標(biāo)作圖如圖2。得方程式：Y= 1.1974X-0.0769，R2=0.9785。

圖2安琪酵母標(biāo)準(zhǔn)曲線

取新分離2種菌培養(yǎng)，與安琪酵母對(duì)比，結(jié)果見表2，培養(yǎng)48h后，菌含量基本相同，則以后新分離菌株的耐酸性和耐酒精度試驗(yàn)可用以上方程進(jìn)行計(jì)算。

表2含菌量的測(cè)定　（cfu/mL）

2.3.2新分離菌種的耐糖性

由表3可知：所有的酵母菌隨著糖濃度的增加，生長量都有所減少，即酵母菌的生長活性都隨著糖濃度的增加而降低，可見，所測(cè)酵母菌最適糖含量為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的糖含量（20%）。與安琪酵母相比，所分離新酵母菌株的耐糖性與其相當(dāng)，較差的只有B3，且A1、C3、C10的耐糖能力稍高于安琪酵母，因此，新分離菌株可用于葡萄酒發(fā)酵中。

表3不同糖濃度的巨峰酵母菌的生長數(shù)量　（×107cfu/mL）

2.3.3新分離菌種的耐酸性

表4不同pH值的巨峰酵母菌的生長數(shù)量（×107cfu/mL）

從表4可以看出，pH值在1～6之間，所測(cè)菌株都能生長，這和魏立杰［15］所分離菌株相似。通過和安琪酵母比較，發(fā)現(xiàn)各株菌最適pH值卻不同：A1、B7、C3最適pH值為4，除了B7生長pH值2～4較廣外，其他2株適合生長的pH值范圍較窄。A5最適pH值為3，pH值在2～5之間生長良好。A10、B3、B10最適pH值為1，甚至更低，但pH值在1～6之間，其生長量較少，不適合作為菌種進(jìn)一步研究；C7和C10最適pH值為2，C7在酸性環(huán)境中生長較弱，C10只在最適pH值時(shí)生長較好。但當(dāng)pH值為6時(shí)，除了安琪酵母，其他菌株生長的都不理想，可見分離菌株的耐堿性較差。總之，菌株B7、A5進(jìn)一步研究的價(jià)值最大，其次為菌株A1、C3、C10。

2.3.4新分離菌種的耐酒精性

從劉向勇等的［12］研究中可以看出，安琪酵母菌對(duì)酒精有較好的耐受性。以安琪酵母為參考，由表5可知：A10、B7和C10耐酒精度較低；A5和B10耐酒精度可達(dá)到15%vol；A1、B3、C3和C7耐酒精度最高，在18%vol的酒精溶液中生長較好。可見，菌株A1、B3、C3和C7進(jìn)一步研究的價(jià)值最大。

3結(jié)論與討論

總結(jié)以上結(jié)果可以得出以下結(jié)論：（1）對(duì)巨峰葡萄就自然發(fā)酵過程中的酵母菌進(jìn)行分離，共得到100株菌，經(jīng)初步分析后，獲得典型的3類酵母菌，共9株；（2）以自然發(fā)酵為對(duì)照，和安琪酵母作比較，新分離菌株對(duì)葡萄糖的利用趨勢(shì)相同，并且發(fā)酵能力較強(qiáng)；（3）以安琪酵母為對(duì)照，對(duì)9株菌進(jìn)行耐受性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除了B3，其他8株菌耐糖性都比較好；耐酸性較好的菌株有A1、A5、B7、C3、C10；能耐較高酒精度的有A1、A5、B3、B10、C3。總結(jié)得出，耐性最好的菌株為A1、A5、C3。

當(dāng)前由于科技手段的提高和分子生物學(xué)研究的深入發(fā)展，對(duì)葡萄酒釀酒酵母的研究已經(jīng)不再局限于只考慮釀酒酵母菌自身特點(diǎn)，選育特殊風(fēng)土環(huán)境的優(yōu)良酵母菌，生產(chǎn)具有明顯地域特色和獨(dú)特風(fēng)格的葡萄酒酵母已成為研究探索的方向［16］。本實(shí)驗(yàn)所分離菌種來自巨峰葡萄自然發(fā)酵過程中，可用于家庭釀造巨峰葡萄酒使用，既提高了家庭自釀葡萄酒的成功率，也會(huì)較好的保存巨峰葡萄自身的香味，應(yīng)用價(jià)值較廣。但如想較好的了解所分離菌株特性，還需進(jìn)一步深入研究。

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Isolation of Yeast Strains from Kyoho Grape and Study on Their Tolerance

JIAChunfeng1，CAO Liuqing1and MAAijin2
（1.Baoding College，Baoding，Heibei 071000；2.China National Institute of Standardization，Beijing 100088，China）

Abstract:Fermenting strains will directly influence wine quality.Kyoho grape resource is rich in China and it is often used as raw materials to produce self-made grape wine.However，yeast strains exclusively used for the fermentation of Kyoho grape was rarely reported before.In this study，100 yeast strains were isolated from naturally-fermented Kyoho grapes by traditional microbial isolation approaches.After preliminary analysis，three typical kinds of yeast strains including 9 strains were finally obtained.Compared with Angel yeast，the obtained strains had the same glucose utilization trend and their fermenting power was strong in the conditions of natural fermentation.Besides，sugar resistance，acid resistance and resistance to high alcohol of 9 strains yeasts were tested with Angel yeast as the contrast，and strains A1，A5，C3 were the strains with highest tolerance.

Key words:Kyoho grape；yeast strain；isolation；tolerance

中圖分類號(hào)：TS262.6；TS261.1；Q93-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）06-0053-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016042

基金項(xiàng)目：保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（14ZN017，14ZN027）；院級(jí)自然課題（2012Z09）。

收稿日期：2016-02-04

作者簡介：賈春鳳（1979-），女，副教授，碩士，研究方向：食品微生物及發(fā)酵工程。

通訊作者：馬愛進(jìn)（1975-），男，博士研究生，副研究員，研究方向：食品微生物及食品相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化。