Mistic融合蛋白促進ω-3脂肪酸去飽和酶Fat-1在大腸埃希菌中高效表達*

趙　艷，柳欣欣，王大新，李湘鳴，陳　平，王　昊

(1.揚州大學臨床醫學院江蘇省蘇北人民醫院醫學實驗研究中心，江蘇揚州 225001；2.揚州大學臨床醫學院江蘇省蘇北人民醫院普外科，江蘇揚州 225001；3.揚州大學醫學院，江蘇揚州　225001)

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Mistic融合蛋白促進ω-3脂肪酸去飽和酶Fat-1在大腸埃希菌中高效表達*

趙艷1，柳欣欣2△，王大新1，李湘鳴3，陳平2，王昊2

(1.揚州大學臨床醫學院江蘇省蘇北人民醫院醫學實驗研究中心，江蘇揚州 225001；2.揚州大學臨床醫學院江蘇省蘇北人民醫院普外科，江蘇揚州 225001；3.揚州大學醫學院，江蘇揚州225001)

[摘要]目的構建真核膜蛋白ω-3 脂肪酸去飽和酶Fat-1基因在大腸埃希菌中的高效表達質粒。方法利用分子克隆技術構建攜帶Fat-1基因的重組原核表達質粒pET32a-Fat-1和插入膜蛋白表達分子伴侶Mistic基因的pET32a-Mistic-Fat-1；將兩種重組質粒轉化大腸埃希菌株BL21(DE3)，IPTG誘導表達Fat-1蛋白和M110-Fat-1蛋白，通過十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)灰度分析其表達量，蛋白免疫印跡法(Western blot)進一步鑒定蛋白表達。結果經酶切鑒定和測序證實成功構建了pET32a-Fat-1和pET32a-Mistic-Fat-1原核表達載體；SDS-PAGE和Western blot證實ω-3脂肪酸去飽和酶Fat-1在原核表達系統中沒有明顯誘導表達，而M110-Fat-1融合蛋白在大腸埃希菌中獲得了高效表達，占全細胞蛋白總量的15%。結論ω-3脂肪酸去飽和酶Fat-1基因與Mistic基因融合表達，實現了在原核宿主中高效表達真核膜整合蛋白ω-3脂肪酸去飽和酶Fat-1。

[關鍵詞]Mistic；ω-3脂肪酸去飽和酶Fat-1基因；膜蛋白；高效表達

ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 PUFA)有提供能量、降脂、抗炎、防癌及抑制腫瘤等有益作用，而ω-6多不飽和脂肪酸(ω-6 PUFA)在很多方面則具有相反的不利影響，如促炎、促腫瘤增殖等有害作用，補充ω-3 PUFA并減少ω-6 PUFA的攝入已成為廣泛共識。ω-3脂肪酸去飽和酶是ω-6 PUFA轉化為ω-3 PUFA的關鍵酶，來自于線蟲的脂肪酸去飽和酶fat-1基因，可以在18～20碳的不飽和脂肪酸的烴鏈中添加一個雙鍵，將ω-6脂肪酸變為ω-3脂肪酸[1-2]。而哺乳動物體內缺乏這種酶，不能自然通過ω-6脂肪酸來產生ω-3脂肪酸，必須依靠飲食補充來源。隨著對脂肪酸代謝在基因水平的不斷深入認識和研究,通過基因工程及轉基因技術獲取大量ω-3 PUFA以滿足人們的需求已成為研究的熱點。

本研究擬用分子生物學技術構建原核表達載體，使Fat-1基因在大腸埃希菌中高效表達。由于ω-3脂肪酸去飽和酶是一種真核跨膜蛋白，在原核系統表達外源性膜蛋白有其不兼容性，有文獻報道其在原核系統中表達效率低[3]。本研究經過文獻檢索,嘗試引入Mistic基因(NCBI序列號:NC_000964.3)作為分子伴侶，Mistic基因最初在枯草芽孢桿菌中發現，是一種細菌膜結合蛋白，編碼的蛋白是M110由110個氨基酸組成，它可以提高真核細胞膜蛋白在細菌細胞膜上的表達[4-6]。本研究設計將ω-3 脂肪酸去飽和酶Fat-1基因與Mistic基因融合表達，大大提高了ω-3 脂肪酸去飽和酶表達效率，為進一步開展ω-3脂肪酸去飽和酶的體外酶學研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料原核表達載體pET32a、菌株大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌 BL21(DE3)均由本室保存； Fat-1基因質粒由上海交通大學吳際教授饋贈。Mistic基因由金唯智生物技術有限公司合成；Hind Ⅲ和EcorⅠ購自Fermentas公司；T4連接酶購自本TaKaRa公司；DNA marker、Phanta?Super-Fidelity DNA聚合酶、ClonExpress?MuitiS One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白Maker及蛋白電泳試劑購自碧云天生物技術公司；質粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒和PCR純化試劑盒購自Axygen公司；酵母粉和胰蛋白胨購自英國Oxoid公司；PCR引物合成及測序由華大基因公司完成；其他均為國產分析純生化試劑。

1.2方法

1.2.1pET32a-Fat-1表達質粒的構建以測序正確的Fat-1質粒為模板，根據已測得的全長序列設計引物，進行PCR擴增。上游引物為：5′-CGG AAT TCA TGG TCG CTC ATT CCA GCG AAG -3′，其中導入EcorⅠ酶切位點；下游引物序列為：5′-CCC AAG CTT TCA CTT GGC CTT TGC CTT CTC -3′，其中導入HindⅢ酶切位點。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳回收， EcorⅠ和HindⅢ酶切pET32a載體和PCR產物，T4連接酶連接，轉化DH5α感受態細胞。挑取單個克隆于5ml LB(Amp+)培養液中培養過夜，提取重組質粒， EcorⅠ/HindⅢ酶切鑒定，陽性克隆提交華大基因公司進行測序分析，見表1。

1.2.2pET32a-Mistic-Fat-1表達質粒的構建以測序正確的pUC57-Mistic質粒為模板,根據Mistic的5′序列和載體pET32a上的酶切位點EcorⅠ及上游序列設計P1，根據Mistic的3′端序列和Fat-1的5′端序列設計引物P2，PCR擴增得到全長Mistic基因；以測序正確的Fat-1質粒為模板，根據Fat-1基因5′端序列設計上游引物P3，根據Fat-13′端序列和載體上的HindⅢ酶切位點及下游序列設計下游引物P4，PCR擴增得到全長Fat-1基因。EcorⅠ和HindⅢ酶切pET32a載體，將載體和兩種PCR產物按比例混合，由重組酶Exnase?MultiS催化重組反應，產物轉化DH5α感受態細胞。挑取單個克隆于5 mL LB(Amp+)培養液中培養過夜，提取重組質粒，EcorⅠ/HindⅢ酶切鑒定，陽性克隆提交華大基因公司進行測序分析。

表1　本研究中所用的引物

1.2.3菌體中表達產物的誘導表達及SDS-PAGE鑒定將經鑒定的原核重組表達質粒轉化宿主菌BL21(DE3)，涂布于含有相應抗生素的LB瓊脂培養板上，37 ℃培養10～16 h。挑選單個菌落接種到含抗生素的5 mL LB管中，與37 ℃劇烈搖動培養8～12 h。取上述培養物按1∶100的比例接種到含抗生素的5 mL新鮮LB管中，37 ℃劇烈搖動培養4 h，使菌液光密度(OD)550達到0.6～0.8時，在轉接管中加入終濃度為0.1、0.3、0.5、0.8和1.0 mmol/L IPTG，30 ℃劇烈搖動，繼續培養4 h，對照管為未誘導的對照菌。分別用1．5 mL離心管收集培養液各約1 mL，12 000 r/min，離心1 min，收集菌體。菌體沉淀以100 μL 磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸浮混勻，取10 μL加5×SDS-PAGE上樣buffer，于100 ℃煮沸10 min，進行SDS-PAGE。0．25%考馬斯亮藍R250染液染膠2 h，脫色液(30%甲醇，10%乙酸)脫色至蛋白帶清晰可見時，分析蛋白質誘導表達結果。同樣方法改變誘導溫度和時間，分析蛋白誘導表達情況。

1.2.4蛋白免疫印跡法(Western blot)鑒定融合蛋白對含pET32a-Fat-1和pET32a-Mistic-Fat-1重組質粒的BL21(DE3)工程菌IPTG 0.3 mmol/L誘導6 h后的表達產物進行Western blot分析，以未誘導菌表達產物為對照。加入小鼠抗His-tag單克隆抗體(1∶1 000)孵育過夜,TBS-T充分洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG作二抗(1∶1 000),孵育1 h，TBS-T充分洗滌，ECL顯影。

2結果

2.1Fat-1基因的生物信息學分析Fat-1基因最早發現源于線蟲， 編碼ω-3脂肪酸去飽和酶。Fat-1基因cDNA全長1 209 bp，翻譯產物是由402個氨基酸組成，相對分子質量約為46．4×103。對蛋白質序列進行跨膜區預測(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMH MM) 表明ω-3脂肪酸去飽和酶是1種有3個跨膜結構的膜蛋白，N末端可能位于胞外，C末端位于胞內。見圖1。

圖1　Fat-1蛋白跨膜區預測

2.2pET32a-Fat-1原核表達質粒的鑒定PCR擴增獲得大小為1 206 bp的片段,將該片段連入表達載體,構建pET32a-Fat-1 重組質粒,經EcorⅠ和HindⅢ雙酶切陽性克隆獲得與理論值相符的目的條帶(圖2) 。測序結果表明，Fat-1 cDNA序列為密碼子優化的Fat-1基因，翻譯的氨基酸序列與公布序列完全一致。

A： M為Marker，1為Fat-1基因PCR產物；B： M為Marker，1為pET32a-Fat-1質粒EcorⅠ和HindⅢ雙酶切產物。

圖2pET32a-Fat-1重組質粒構建電泳

2.3pET32a-Mistic-Fat-1原核表達質粒的鑒定PCR擴增獲得大小為1 206 bp的Fat-1片段和330 bp的Mistic片段,將兩個片段無縫拼接重組連入表達載體。構建的pET32a-Mistic-Fat-1 重組質粒,經EcorⅠ/HindⅢ雙酶切陽性克隆獲得2條與理論值相符的1 536 bp的目的片段和載體片段(圖3)。DNA測序證明插入序列是目的序列，且與融合表達載體的讀碼框相符。

M：Marker；1：pET32a-Mistic-Fat-1質粒EcorⅠ和HindⅢ雙酶切產物。

圖3pET32a-Mistic-Fat-1重組質粒酶切鑒定圖

2.4重組蛋白Fat-1在大腸埃希菌BL21中的誘導表達轉化pET32a-Fat-1重組質粒的BL21不同濃度 IPTG誘導后，SDS-PAGE結果顯示，預期在相對分子質量約64×103的位置上出現誘導的蛋白條帶，但是與對照組相比并沒有明顯增亮的條帶，見圖4。

M：蛋白Marker條帶及相對分子質量；1～6：未誘導組與不同濃度IPTG誘導組(0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L)的全細胞。

圖4Fat-1蛋白誘導表達10%SDS-PAGE

M：蛋白Marker條帶及相對分子質量；1～6：未誘導組與不同濃度IPTG誘導組(0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L)的全細胞。

圖5M110-Fat-1蛋白誘導表達8%SDS-PAGE

2.5重組蛋白M110-Fat-1在大腸埃希菌BL21中的誘導表達轉化pET32a-Mistic-Fat-1重組質粒的BL21在不同濃度IPTG誘導后，SDS-PAGE結果顯示，與未誘導的對照組相比，在相對分子質量約為78×103的位置上出現一條較濃集帶(圖5)，說明插入的融合基因已經在大腸埃希菌中表達。重組蛋白在30 ℃，0.3 mmol/L IPTG誘導6 h后表達量較高，灰度掃描分析占全細胞總蛋白的15%，見圖6。

M：蛋白Marker條帶及相對分子質量；1：未誘導組全細胞；2：0.3 mmol/L IPTG，30 ℃誘導6 h全細胞；3： 0.3 mmol/L IPTG，25 ℃誘導16 h全細胞；4：0.3 mmol/L IPTG，20 ℃誘導20 h全細胞。

圖6M110-Fat-1蛋白誘導表達8%SDS-PAGE

2．6Western blot檢測用抗His-tag單克隆抗體對Fat-1和Mistic-Fat-1融合蛋白進行Western blot檢測?？笻is-tag的抗體可以檢測到相對分子質量約為78×103的Mistic-Fat-1融合蛋白高效表達條帶，而Fat-1融合蛋白在相對分子質量約64×103的位置上出現了較弱的誘導蛋白條帶，見圖7。

1,2:未誘導與誘導的含pET32a-Fat-1和重組質粒的表達產物;3,4:未誘導與誘導的含pET32a-Mistic-Fat-1重組質粒的表達產物。

圖7Western blot檢測

3討論

本文通過將ω-3 脂肪酸去飽和酶Fat-1基因與Mistic基因融合表達，實現了在原核宿主中高效表達真核膜蛋白ω-3質粒脂肪酸去飽和酶。在原核系統表達外源性真核膜蛋白有其不兼容性，在真核系統表達有利于其活性的發揮，但是相對昂貴，與Mistic蛋白融合高效表達外源性真核膜蛋白提供了一種相對簡單并且廉價的方法。在大腸埃希菌中單獨表達Fat-1基因時其產量很低，原因可能是膜蛋白在大腸埃希菌中過度表達，暴露的疏水性靶向信號超出了信號識別顆粒，大腸埃希菌易位復合子過飽和，進一步導致膜蛋白表達被抑制[7]。

Mistic是一種在枯草芽孢桿菌中發現的膜整合蛋白，2005年Roosild等[8]首次報道了Mistic蛋白的溶解結構，并且預測它作為伴侶與目的蛋白N-末端融合表達，可以提高外源性膜蛋白在大腸埃希菌中的表達水平。國內外有文獻報道它作為伴侶分子輔助了組氨酸激酶受體、葉綠體ATP/ADP轉運體、G蛋白偶聯受體、鹽藻八氫番茄紅素脫氫酶等多種真核膜蛋白分子的高效表達[7,9-11]。有研究表明，Mistic蛋白單獨表達或融合表達時都缺乏信號識別序列，過表達無明顯組織毒性，它的合成和轉運到細胞膜有可能繞過大腸埃希菌易位子復合體[8]。Mistic有緊湊的4個α螺旋結構，不同于其他膜蛋白，這4個螺旋結構并不形成疏水跨膜部分，它的表面富有極性和帶電殘基，有特殊的表面親水性質，是這種表面極性而不是疏水性促使它與細胞膜結合緊密，對膜蛋白在大腸埃希菌中的表達起到強大的促進作用，并增加其溶解性[12]。

去飽和酶均是多次跨膜的固有膜蛋白，他們的過量表達即是進行相關研究的第一步，也是最大的瓶頸之一。本文利用遺傳工具成熟的大腸埃希菌表達系統，結合與Mistic的融合表達，成功過量表達了ω-3脂肪酸去飽和酶，實現分子生物學意義上的過量表達。此研究結果為進一步對跨膜型脂肪酸去飽和酶的結構和功能研究奠定基礎,為改造出一個高活性的ω-3脂肪酸去飽和酶的研究奠定基礎。在原核宿主中重組高效表達ω-3脂肪酸去飽和酶，作用于18～20碳的脂肪酸底物，有效將ω-6脂肪酸轉變為ω-3脂肪酸，具有重要的醫學和營養學價值。

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Fusion to Mistic improved fatty acid desaturase Fat-1 overexpression in E.coli*

Zhao Yan1,Liu Xinxin2△,Wang Daxin1,Li Xiangming3,Chen Ping2,Wang Hao2

(1.MedicalResearchCenter,NorthernJiangsuPeople′sHospitalClinicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225001,China;2.DepartmentofGeneralSurgery,NorthernJiangsuPeople′sHospitalClinicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225001,China;3.MedicalCollege,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225001,China)

[Abstract]ObjectiveTo construct a highly efficient expression plasmid of eukaryotic nuclear membrane protein Omega 3 fatty acid desaturase gene Fat-1 in E.coli.MethodsUsing molecular cloning technology to construct the recombinant prokaryotic expression plasmid pET32a Fat-1 and pET32a-Mistic-Fat-1 fused with Membrane proteins expression chaperon mistic;the two recombinant plasmids were transformed into E.coli strain BL21 (DE3),the expression of Fat-1 protein and M110 Fat-1 protein induced by IPTG were identified by SDS-PAGE and gray degree analysed the amount of expression,further identified by Western blot.ResultsThe results of enzyme digestion and sequencing demonstrated that we successfully constructed the prokaryotic expression vectors pET32a Fat-1 and pET32a-Mistic-Fat-1;SDS-PAGE and Western blot showed that Fat-1 fatty acid desaturase wasn′t significantly induced,but the overexpression of M110 Fat-1 fusion protein was obtained in E.coli,accounting for 15% of the total amount of whole cell proteins.ConclusionThe fusion with Mistic proteins to express the Fat-1 gene has realized the overexpression of eukaryotic nuclear membrane integrated protein Omega 3 fatty acid desaturase in prokaryotic host.

[Key words]Mistic;ω-3 fatty acid desaturase Fat-1;membrane protein;overexpression

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.010

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(81300721)；揚州市科技計劃項目(YZ2014204)。

作者簡介：趙艷(1982-)，主管技師，碩士，主要從事醫學檢驗和臨床營養研究。△通訊作者，Tel:18051061376；E-mail:gorilla1999@hotmail.com。

[中圖分類號]R34

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)16-2190-04

(收稿日期：2015-11-30修回日期：2016-02-16)