弓形蟲CDPK5基因多克隆抗血清的制備及功能鑒定*

鐘亮尹，劉思敏，曾智華，徐曉松，盧漢威，周文超，黃演婷，盧景輝，陳思聰

(廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣州 510080)

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弓形蟲CDPK5基因多克隆抗血清的制備及功能鑒定*

鐘亮尹，劉思敏，曾智華，徐曉松，盧漢威，周文超，黃演婷，盧景輝，陳思聰

(廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣州 510080)

[摘要]目的篩選弓形蟲(Tg)CDPK5基因序列的免疫多肽，將合成多肽免疫新西蘭白兔制備多抗血清，并對其功能進行鑒定。方法利用生物信息學的方法分析確定Tg CDPK5序列免疫多肽，再用合成的多肽免疫新西蘭白兔制備多抗。收集多抗血清，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測定多抗滴度，蛋白免疫印跡法(Western blot)鑒定免疫活性，免疫熒光實驗分析Tg CDPK5的亞細胞定位。結果通過生物信息學分析，選擇Tg CDPK5序列N端一段長17 bp的多肽序列作為免疫多肽；用合成的多肽免疫兔子，成功獲得多抗血清。ELISA測定多抗血清效價為1∶640 000；Western blot證明該多抗血清能特異性識別Tg CDPK5(75.4×103)條帶；免疫熒光實驗結果表明，該多抗能特異性識別弓形蟲內源Tg CDPK5蛋白。結論研究根據(jù)Tg CDPK5序列信息的分析，獲得Tg CDPK5序列免疫多肽，并制備兔源多克隆抗體。

[關鍵詞]弓形蟲;CDPK5基因;多抗血清;免疫熒光

弓形蟲(toxoplasma gondii,Tg)是一種頂復門寄生蟲，可感染幾乎所有哺乳動物和鳥類，引起人獸共患的弓形蟲病[1]。由于其傳播能力極強，對畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生安全的危害極大。全世界大約有1/3的人感染Tg[2]，但多數(shù)為隱形感染。在免疫力低下或免疫缺陷患者中，這種潛伏性感染可被激活，進而引起嚴重的損害；孕婦感染Tg可引起流產(chǎn)、死胎或畸形；另外，30%～70%患有先天性弓形蟲病的新生兒會繼發(fā)視網(wǎng)膜病變[3]。目前，治療弓形蟲病的經(jīng)典藥物仍以乙胺嘧啶聯(lián)合磺胺類藥物為主，但其缺點是療程長達1年以上，具有不良反應，而且僅對Tg滋養(yǎng)體有抑制效果，不能治愈弓形蟲病[4]；阿奇霉素是惟一對包囊和速殖子均有一定作用的藥物，半衰期長，不良反應較少，但長期服用會產(chǎn)生細胞毒性和耐藥性。因此，面對不斷增長的Tg感染患者和Tg抗藥性的產(chǎn)生，開發(fā)新的抗Tg藥物不但至關重要而且面臨著急迫性。

鈣依賴的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)家族是一類鈣離子(Ca2+)結合的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對Ca2+信號轉導通路下游元件的調控具有重要作用。Ca2+作為Tg細胞內多種生理生化過程的重要環(huán)節(jié)，其水平的異常直接導致細胞功能的異常。研究發(fā)現(xiàn)，Tg CDPKs可參與調控Tg入侵宿主細胞、蛋白分泌、運動，及分化等生理過程[5]。除此之外，一些CDPKs具有良好的免疫原性，不僅能刺激淋巴細胞增殖，還能誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，被認為是研發(fā)針對頂復門原蟲新型生物制劑的候選基因[6]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，Tg CDPKs基因大約有11個。已經(jīng)被證實的有CDPK1、CDPK2、CDPK3及CDPK4[7]。進一步研究發(fā)現(xiàn),Tg CDPK5可能與Tg的細胞毒力、侵襲力相關[8]。然而關于Tg CDPK5對Tg生長、毒力、侵襲力、微線體分泌，以及水甘油滲透性的調控作用報道較少。為了研究Tg CDPK5對Tg的生物學功能，Tg CDPK5蛋白多抗是實驗研究的重要材料之一。本研究擬通過經(jīng)典多抗制備方法獲得兔抗Tg CDPK5多克隆抗體，并通過相應檢測方法，確定該多抗的效價以及特異性，旨在為Tg CDPK5基因后續(xù)研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1Tg蟲株Tg蟲株為剛地Tg ME49株(Ⅱ型蟲株)，液氮保種，復蘇后腹腔接種小鼠傳代。

1.1.2主要試劑免疫多肽由廣州瑞博奧生物科技有限公司合成；馬來酰亞胺活化的BSA、KLH偶聯(lián)試劑盒(MBK1)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨、四甲基乙二胺(TEMED)、脫脂奶粉為Sigma公司產(chǎn)品，多聚甲醛，30%丙烯酰胺購自弗德生物，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、購自Roche公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG抗體購自Santa Curz，蛋白質Marker購自Fermentas公司；PVDF膜購自BioRad公司，TMB底物顯色液、Alexa Fluor488標記的羊抗鼠IgG抗體購自Invitrogen，蛋白免疫印跡法(Western blot)底物顯色液購自Thermo fisher Scientific，BSA、TritonX-100購自碧云天生物技術研究所，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1Tg CDPK5免疫多肽的獲得根據(jù)NCBI中TgCDPK5序列(NCBI序列號：XM_002366128.1)，使用TMHMM軟件和BCPREDS Server 1.0軟件對TgCDPK5的跨膜區(qū)和B細胞線性抗原表位進行預測。選取具有高度抗原性的非跨膜區(qū)保守序列，并委托廣州瑞博奧生物科技有限公司合成多肽。

1.2.2多克隆抗體的制備與純化合成的多肽用試劑盒偶聯(lián)BSA或KLH。將偶聯(lián)多肽溶于無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，以等體積的比例分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑進行充分乳化作為免疫原。將獲得的免疫原免疫新西蘭大白兔(雄性，1.5 kg)。經(jīng)背部皮下多點注射，第3次免疫3 d后，耳緣靜脈取血，測抗體效價。待血清效價達到一定值后，常規(guī)心臟取血，收集血清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ媒Y合緩沖液稀釋多抗血清后于0.45 μm濾膜過濾，加樣到IgG親和層析柱，流速1 mL/min至基線，用洗脫緩沖液(100 mmol/L甘氨酸-HCl，pH 2.5)洗脫后，收集洗脫峰為純化的多克隆抗體。取5 μL進行十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，觀察純化后結果。

1.2.3多克隆抗血清效價鑒定采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測抗血清效價：每孔100 ng包被原于4 ℃包被過夜，第2天用1%BSA-PBS封閉1 h；洗滌后，加入梯度稀釋的多克隆抗血清孵育2 h，以正常兔血清作為陰性對照。洗滌后，加入1∶10 000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG孵育1 h，TMB顯色。用ELISA檢測儀測定450 nm處的吸光度(A)值。

1.2.4多抗血清免疫活性鑒定樣本為1×107數(shù)量的純化的Tg，Tg用人包皮成纖維細胞(HFF-1)培養(yǎng)，用3 μm濾膜純化。超聲裂解蟲體后，取上清液經(jīng)12%SDS-PAGE、轉膜、封閉后，以免疫前正常兔血清為陰性對照，制備的Tg CDPK5抗血清為一抗，羊抗兔HRP-IgG為二抗，ECL顯色，觀察結果。

1.2.5免疫熒光實驗分析Tg CDPK5的亞細胞定位以免疫前正常兔血清為陰性對照，取純化的Tg涂于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，室溫晾干。加入4%多聚甲醛固定10 min，PBST洗滌3次，每次5 min。加入0.1%Triton-X-100，透化15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。加入PBS固定30 min后，加入制備的Tg CDPK5抗血清作為一抗1∶100稀釋，孵育1 h。PBS洗滌3次，每次5 min。1∶1 000的比例加入二抗(Alexa Fluor488標記的羊抗鼠IgG)，孵育1 h，避光，室溫。PBS洗滌3次。加入DAPI染色10 min，PBST洗滌1次，上機照相。

2結果

2.1Tg CDPK5免疫多肽序列分析利用TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析Tg CDPK5(GenBank:EPT26997.1)的跨膜區(qū)域，分析結果顯示該基因無跨膜區(qū)(圖1)。因此在選取多肽制備抗體時不用避免跨膜區(qū)，可以選擇氨基酸序列N端或C端免疫原性評分較高的區(qū)域選擇多肽。利用IEDB網(wǎng)站(http://www.iedb.org/)中的Bepipred Linear Epitope Prediction軟件(http://tools.immuneepitope.org/bcell/help/#Bepipred)預測B細胞表位。基線以上黃色區(qū)域評分較高的可以作為候選的多肽，見圖2。

圖1　Tg CDPK5的跨膜區(qū)分析

圖2　B細胞表位分析

序號起點位置末端位置多肽序列長度(bp)1622AATKTSPVTAVVPGDSV1723238NGDATGA734459STPRTEKASATRCSTP16467111GRNTDVPEDGKDAAAVGEGNTKRGLDDFDADYGCRGGDCCDTSTK455123139N121EGKDKSQHDRREP176151159MNASEASRW97164200QCNSTCPGDGFDGASGTTAADGI181PASPQPEAPVF378215238QQITDIYDTPNGTSLGKGSYGSVV24

2.2免疫多肽的確定表1列舉了Tg CDPK5序列N端的評分較高的多肽。按照結合多肽長度為15～20 bp較為合適的原則，選擇表格中紅色標注的多肽序列進行合成，獲得Tg CDPK5免疫多肽。

2.3多克隆抗血清效價鑒定以純化的Tg CDPK5合成多肽作為抗原包被ELISA反應板，已采集的多克隆抗體為一抗，同時以未免疫的兔血清為陰性對照，1∶10 000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG為二抗，效價以實驗組的A450(P)/陰性血清對照組的A450(N)>2.1作為判定陽性的標準，檢測結果顯示多抗血清的效價為1∶640 000，見圖3。對該多克隆抗體進行親和純化，純化結果見圖4。

圖3　抗TgCDPK5蛋白多克隆抗血清效價分析

2.4多抗血清免疫活性鑒定Western blot實驗結果表明，以免疫前正常兔血清作為對照，制備的抗Tg CDPK5抗體能特異性識別Tg的天然Tg CDPK5蛋白，在約75×103處可見一條特異性條帶，而正常兔血清中未見(圖5)。可見抗Tg CDPK5血清能特異性識別Tg CDPK5(75.4×103)條帶。

2.5免疫熒光實驗以免疫前正常兔血清作為陰性對照，進一步的免疫熒光實驗結果表明，該多克隆抗體能特異性識別Tg內源Tg CDPK5蛋白。除此之外，通過DAPI核染發(fā)現(xiàn)，該蛋白以可溶的形式存在于蟲體細胞質中。

M:Marker。

圖4Tg CDPK5多抗純化

1：抗血清；2：正常兔血清。

圖5多克隆抗血清對天然的TgCDPK5蛋白的識別

綠色熒光：CDPK5；藍色熒光：細胞核。

圖6免疫熒光實驗檢測Tg CDPK5蛋白細胞定位

3討論

CDPKs是一類龐大的蛋白激酶家族，屬于絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，廣泛存在于各種植物及原生動物中。研究表明，Tg CDPK1能夠有效的調控Ca2+依賴的胞外分泌，抑制Tg CDPK1的表達導致Tg運動性降低、入侵/離開宿主細胞能力減弱[9]；Tg CDPK3與惡性瘧原蟲CDPK1(PfCDPK1)高度同源(約50%)，對Tg離開宿主細胞的過程至關重要[10-11]。Zhang等[8]將真核表達質粒pVAX-TgCDPK5注射昆明鼠后產(chǎn)生強烈的細胞Th1免疫應答并一定程度上提高了感染Tg小鼠的生存時間，提示TgCDPK5可能與細胞毒力、侵襲力相關。本研究所涉及的Tg CDPK5基因(NCBI檢索號：EPT26997.1)是Tg重要的功能基因，由682個氨基酸組成，其定位與生物學功能尚不清楚。關于Tg CDPK5對Tg生長、毒力、侵襲力、微線體分泌，以及水甘油滲透性的調控作用均未見報道。

為探究Tg CDPK5編碼蛋白的功能，獲得Tg CDPK5抗體顯得意義重大。本實驗通過生物信息學分析獲得Tg CDPK5免疫多肽，成功制備了兔抗Tg CDPK5多克隆抗體。對于CDPKs在功能方面的研究通常采用生化方法來進行，可直接測定或使用特異性的激活劑來識別該酶的特異調節(jié)因子[12]。除此之外，較難通過直接提取和純化的方式獲得該蛋白。雖然體外表達目的蛋白可以獲得具有天然活性的蛋白激酶，但該方法繁瑣，需較大工作量。本研究通過對Tg CDPK5的序列信息分析，發(fā)現(xiàn)該基因無跨膜區(qū)，因此可以選擇氨基酸序列N端或C端免疫原性評分較高的區(qū)域選擇多肽。通過對Tg CDPK5蛋白的免疫原性分析，本研究選定該序列N端一段長17 bp的多肽序列進行合成，從而獲得制備多抗所需的Tg CDPK5免疫多肽。該方法較之體外表達目的蛋白的方法更加簡便直接，可以獲得特異性較強的抗原，為后續(xù)抗體的成功制備奠定基礎。

綜上所述，本實驗不僅制備了能特異性識別Tg內源性Tg CDPK5蛋白的兔抗Tg CDPK5多克隆抗體，還利用該多抗證實了Tg CDPK5蛋白以可溶形式存在于蟲體細胞質中。在接下來的實驗中，該抗體將會發(fā)揮更多使用價值。了解Tg CDPK5的作用機制，針對Tg CDPK5獨特的生物學特性進行藥物設計，對治療Tg的藥物研發(fā)具有指導性作用，也對頂復門其他原蟲的藥物研究有一定借鑒意義。

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Preparation of the polyclonal antibodies of CDPK5 gene from toxoplasma gondii and the identification of its functions*

Zhong Liangyin,Liu Simin,Zeng Zhihua,Xu Xiaosong,Lu Hanwei,Zhou Wenchao,Huang Yanting,Lu Jinghui,Chen Sicong

(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou,Guangdong510080,China)

[Abstract]ObjectiveScreening the immune polypeptide sequence of toxoplasma (Tg) CDPK5 gene,which were synthesized and then immunized the New Zealand white rabbit to prepare antiserum,and identification its function.MethodsBioinformatics analysis was used to determine the immune peptide of Tg CDPK5 sequence,which were artificially synthesized to immune white rabbit to prepare antiserum.The titers of antibodies were determined by ELISA and the polyclonal antibodies were verified with CDKP5 antigen by Western blot.The sub-cellular localization of Tg CDPK5 were obtained by immunofluorescence assay.Results17 bp peptide sequence from the Tg CDPK5 N-terminal were chosen as immune polypeptide by bioinformatics analysis.Synthetic peptide were used to immune rabbit to obtain polyclonal antiserum.The result showed that the titer of the obtained ployantibody were 1∶640 000;Western blot demonstrated that the antiserum could specifically recognize Tg CDPK5(75.4×103);Immunofluorescence assay revealed this antibody could specifically recognize the endogenous Tg CDPK5 of Toxoplasma gondii.ConclusionAccording to the analysis of Tg CDPK5 sequence information,this study successful obtained Tg CDPK5 polyclonal antibody.

[Key words]toxoplasma gondii;CDPK5 gene;antiserum;immunofluorescence assy

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.008

*基金項目：廣東省醫(yī)學科學技術研究基金項目(2015120124650789)。

作者簡介：鐘亮尹(1966-)，副主任技師，本科，主要從事臨床免疫學研究。

[中圖分類號]R392.7

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)16-2182-04

(收稿日期：2016-01-08修回日期：2016-03-28)