水熱法制備磁性微球及其在植物基因組DNA提取分離中的應用

杜 鮮，孫培培，張 虹，張富昌，石 峰

(石河子大學生命科學學院，新疆石河子832000)

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水熱法制備磁性微球及其在植物基因組DNA提取分離中的應用

杜 鮮，孫培培，張 虹，張富昌，石 峰*

(石河子大學生命科學學院，新疆石河子832000)

摘要[目的]建立一種適用于多種植物組織快速提取基因組DNA的方法。[方法]以水熱反應制備出Fe3O4磁性納米微球，并對其粒徑、形貌、磁學性質等進行表征分析，并以此作為核酸提取載體，對多種新疆特色經濟作物和植物的葉片、根、莖、籽粒等組織進行DNA的提取分離，并優化分離純化過程的各環節。[結果]通過OD260紫外吸收值的檢測、瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，用該方法純化得到的植物基因組DNA純度高、完整性好，能夠滿足下游分子生物學操作對基因組DNA質量的要求。[結論]建立了一種簡便、快速、普適的從多種植物組織中獲得高產量和高純度的基因組DNA，為全自動化、規模化提取DNA提供了理論和實踐基礎。

關鍵詞磁性納米微球；水熱法；基因組DNA；純化；植物組織

隨著植物分子生物學的快速發展，用簡便、快速、普適的方法從多種植物組織中獲得高產量和高品質的基因組DNA，是核酸提取需要解決的關鍵問題[1]。在新疆特殊生境下，極端抗逆植物蘊含豐富的寶貴基因資源，對其基因組DNA的高質量提取純化對后期的基因克隆、轉基因育種起著重要的作用，然而新疆特殊生境下的植物含有大量的多糖、多酚、色素等次生類物質，用快速簡便的方法提取高質量、高純度的DNA較為困難[2-3]。目前常用的DNA提取方法有酚-氯仿抽提法、離子交換介質法、高鹽沉淀法和硅介質吸附法[4]。這些方法提取過程復雜、耗費時間長，需要有毒的試劑且對操作者技術水平要求高，無法滿足對DNA提取技術高純度、高效率、自動化的要求。因此，迫切需要開發一種自動化、高通量、快速提取植物樣本核酸的方法。

納米科技和生物技術相結合的新興產業納米生物技術近年來在國內外迅速發展，其中，磁性納米材料的制備及其相關生物技術產品開發利用受到國內外學者的廣泛關注[5]。磁性納米粒子因具有高比表面積、高飽和磁化強度和高生物相容性等優勢而被應用于核酸提取、蛋白質純化、酶的固定化、免疫學檢測及磁導靶向給藥等生物醫學領域[6-8]。基于磁性微球的核酸提取分離法，近年來已被應用于各種疫病快速PCR檢測、法醫鑒定等領域[9]。

筆者采用高鹽緩沖體系中磁性納米微球結合核酸，利用低鹽緩沖液洗脫的原理，建立了一種基于Fe3O4磁性納米微球為載體的植物全基因組提取方法，該方法省去了多次的溫浴、抽提、離心等步驟，節約了大量時間，旨在為全自動化、規模化提取核酸提供了理論和實踐基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。鹽芥、旱麥草、費爾豬毛菜、烏拉爾甘草、棉花、小麥新冬20、紫花苜蓿等植物材料均由石河子大學生命科學學院植物分子生物學實驗室提供。

1.1.2藥品試劑。FeCl3·6H2O、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、鹽酸胍、瓊脂糖均為分析純，購于Aldrich公司；乙二醇、醋酸鈉、聚乙二醇(PEG-8000、PEG-2000)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸等均為國產分析純；植物組織DNA提取所用裂解液、植物清洗液、結合緩沖液、洗脫液等均為新鮮配制。

1.1.3儀器設備。水熱合成反應釜(50 mL)購于河南鞏義予華儀器有限公司；磁力攪拌器、懸臂式攪拌器均購于IKA集團；超聲波清洗機(KQ-100E)購于昆山市超聲儀器有限公司；真空干燥箱(DZF-6020)購于上海一恒科學儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀(AVATAR 360FT-IR)購于美國尼高力儀器公司；振動樣品磁強計7307(VSM)購于美國Lake Shore公司產品；水平電泳槽購于北京六一儀器廠。

1.2方法

1.2.1水熱法制備Fe3O4納米粒。將40 mL乙二醇加入50 mL 反應釜的聚四氟乙烯內襯中，準確稱取1.35 g FeCl3·6H2O(5 mmol，98%)加入到40 mL乙二醇中，電磁攪拌20 min，使之完全溶解形成溶液；繼續向其中加入3.6 g醋酸鈉 和1.1 g PEG2000，將混合液繼續劇烈攪拌30 min，然后將其置于超聲清洗儀中，超聲10 min，再離心5 min；如此反復3次，直至溶液充分溶解混勻。然后將水熱反應釜封閉擰緊后置于預先加熱到200 ℃的電熱鼓風干燥箱中，并繼續保持200 ℃，反應11 h；待反應完畢后關閉電熱鼓風干燥箱電源，繼續將水熱合成反應釜置于其中，自然冷卻至室溫。

1.2.2Fe3O4納米粒的清洗與濃度測定。Fe3O4納米粒的清洗：將反應產物轉移至一干凈的燒杯中，加入約30 mL無水乙醇，用玻璃棒攪拌均勻，置于5 000 T的磁鐵上磁性分離10 min左右，之后棄掉上懸液。再加入約30 mL無水乙醇，置于超聲波清洗機上超聲清洗10 min，之后放置在磁鐵上磁性分離。重復以上清洗步驟4次，直至上懸液清亮。再用去離子水清洗磁粒3 次，將所得的產物用11 mL去離子水重新分散后保存。

磁性納米微球濃度的測定：取一個清洗干凈的小燒杯，在烘箱中烘干8 h，放入干燥器中冷卻至室溫，稱重W1。量取1 mL Fe3O4納米粒加入到小燒杯中，烘干8 h，稱重W2，由以下公式可得到磁性納米微球的濃度。

磁性納米微球的濃度(g/mL)=(W2-W1)/mL

1.2.3Fe3O4磁性微粒的表征。利用透射電子顯微鏡觀察Fe3O4磁性納米微球形貌并測試粒徑大小及分散狀態；同時用掃描電子顯微鏡(SEM)表征：觀察Fe3O4磁性納米微球的大小、表面特征及形貌。Fe3O4磁性納米微球粒徑大小及其粒徑分布用馬爾文公司的激光粒度散射儀(DLS)進行表征測定。Fe3O4磁性納米微球的磁學性質(磁滯回線、矯頑力等)用振動磁強計(VSM)進行表征測定。

1.2.4植物葉片基因組DNA提取分離工藝。將水熱法制備的Fe3O4磁性納米微球渦旋混勻，用移液器移取100 μL于2 mL離心管中，磁性分離1 min，棄上清。 從磁性分離器上取出離心管，在Fe3O4磁性納米微球中加入350 μL結合液，吹吸混勻，待用。植物葉片組織樣品處理：稱取300 mg植物組織，置于研缽中，加入液氮研磨至細粉狀，在組織解凍前向研缽中加入1.8 mL裂解液，研磨混勻，各吸取600 μL于2個新的2 mL離心管中，然后放于65 ℃ 水浴 25 min(期間每隔5 min顛倒離心管1次)。向離心管中加入5 μL RNase A，充分混勻，于37 ℃水浴 5 min后取出。 向離心管中加入1.2 mL氯仿，輕輕搖動2 min，隨后12 000 r/min離心5 min。取上清約350 μL加入到已處理好的Fe3O4磁性納米微球中，移液器吹打混勻，室溫靜置 5 min。再將離心管置于磁性分離器上分離 3～5 min，棄去上清。向管中加入 400 μL 清洗液，移液器吹打混勻，磁性分離，去上清。向管中加入 400 μL清洗液，移液器吹打混勻，磁性分離，去上清。將管蓋打開，室溫晾干 5 min。 向管中加入 100 μL 洗脫液，移液器吹打混勻，于 60 ℃ 水浴 5 min。 磁性分離直至上清澄清，上清即為純化的植物組織基因組 DNA，將上清轉移至另一離心管中，可直接用于后續試驗或于-20 ℃低溫保存。

1.2.5不同濃度Fe3O4磁性納米微球對提取結果的影響。將水熱法制備的Fe3O4磁性納米微球稀釋成4個濃度：13、26、30、39 mg/mL，分別應用于小麥葉片DNA分離提取，通過紫外-可見光譜鑒定。

1.2.6DNA完整性的測定。經純化后的植物組織基因組DNA通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。

1.2.7DNA純度、濃度的測定。將純化后的植物組織基因組DNA吸取5 μL在超微量分光光度計(nanodrop核酸蛋白分析儀)的測試孔上，打開操作系統，即可測定其濃度c(ng/μL)和純度(OD260/OD280)。 其中DNA含量的計算：每100 mg植物組織能夠提取的DNA的量(μg)=c×100(μL)÷1 000(μg/ng)。

2結果與分析

注：a.未加磁場，b.外加磁場。Note:a.Without magnetic field;b.Adding magnetic field.圖1　Fe3O4磁性納米微球在外加磁場前后的形態Fig.1　Morphology of Fe3O4 magnetic nano-microsphere before and after magnetic field

2.1Fe3O4磁性納米微球制備和表征結果經過水熱法制備的材料經過清洗呈典型的Fe3O4磁性納米材料的黑色懸液，在室溫下能夠長久保持膠體狀態而不會發生絮凝沉淀(圖1a)。當外加5000 T磁場時，制備的磁性微球會在20 s內全部移至外加磁場一側，上清液呈清亮無色無殘留雜質(圖1b)。說明用上述方法制備的Fe3O4磁性納米微球具有較好的分散性，而在外界磁場作用下又具有很強的磁響應性。由圖2a可知，產物的衍射特征峰分別對應晶體的(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)晶面，與具有尖晶石型結構的Fe3O4標準譜圖JCPDS 標準卡片(JCPDS no.85-1436)完全吻合，XRD 數據中未檢測到其他雜相的衍射峰，可以斷定所得樣品為單一相的純Fe3O4。由圖2b可知，樣品在外加磁場達到飽和時的磁化強度為62.6 emu/g，表現出強的鐵磁性。由圖2d可知，所制備的Fe3O4磁性納米微球呈單分散狀態，粒徑均一，將制備的Fe3O4磁性納米微球用激光粒度儀進行表征分析(圖2c)，結果表明，其粒徑主要分布在200～600 nm，其中，300 nm粒徑的Fe3O4磁性納米微球所占比例最高。

注：a.粒徑分析圖；b.電鏡圖；c.磁滯回線圖；d. X射線衍射圖。Note: a. Particle size analysis chart; b. Electron microscope; c. Hysteresis loop diagram; d. X-ray diffraction pattern. 圖2　Fe3O4磁性納米微球的表征結果Fig.2　Characteristics of prepared Fe3O4 magnetic nano-microsphere

2.2Fe3O4磁性納米微球提取植物基因組DNA的效果由表1可知，當磁性微球濃度為13、26、30、39 mg/mL時，提取量分別為18.2、25.3、 29.6和32.0 μg，純度分別為1.95、1.88、1.82和1.64，說明所用Fe3O4磁性納米微球濃度越高，所提取的核酸產量越高，但提取產物中蛋白等雜質較高，DNA純度越低。經過多次試驗優化選擇，確定用30 mg/mL的磁性納米微球作為提取植物葉片的載體濃度。

表1不同磁性微球濃度提取小麥基因組DNA的產量和純度

Table 1Yields and purities of wheat genomic DNA using different magnetic microparticles concentration

磁性微球濃度Magneticmicroparticlesconcentration∥mg/mLOD260/OD280提取量Yieldsμg131.9518.2261.8825.3301.8229.6391.6432.001.980

將該方法所制備的Fe3O4磁性納米微球應用于鹽芥、小擬南芥、旱麥草、費爾豬毛菜、烏拉爾甘草、棉花、小麥新冬20、紫花苜蓿葉片組織全基因組DNA的提取。提取的DNA經0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，DNA條帶單一、清晰、DNA完整性好，無降解產生(圖3)。經NanoDrop 2000c Spectrophotometer(表2)檢測其DNA的量和純度，結果顯示，其得率較高，OD260/OD280在1.78～1.93，說明純度較高。

注：1、2號為棉花葉片；3、4號為葡萄葉片；5、6號為小麥葉片；7、8號為玉米葉片。Note: 1, 2. Cotton leaf; 3, 4. Grape leaf; 5, 6. Wheat leaf; 7, 8. Corn leaf. 圖3　不同植物葉片DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3　Agarose gel electrophoresis of DNA from different plant leaves

以鹽芥的根、莖、葉片以及籽粒為材料，以水熱法合成的磁性微球為提取載體，進行DNA的提取分離，結果表明，經0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的DNA條帶清晰均一、完整性好，無降解產生(圖4)。經NanoDrop 2000c Spectrophotometer檢測其DNA的量和純度，結果顯示，OD260/OD280在1.64～1.94，說明提取的DNA中雜質較少，純度較高(表3)。

表2　不同植物葉片DNA的紫外檢測結果

注：1號為葉片；2號為根；3號為莖；4號為籽粒。Note: 1. Leaf; 2. Root; 3. Stem; 4. Grain. 圖4　鹽芥不同組織部位DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.4　Agarose gel electrophoresis of DNA from different Thellungiella salsuginea tissue

Table 3UV detection results of DNA from differentThellungiellasalsugineatissue

樣本名稱SamplesOD260/OD280提取量Yields∥μg鹽芥葉片Thellungiellasalsuginealeaf1.9518.2鹽芥根Thellungiellasalsuginearoot1.8825.3鹽芥莖Thellungiellasalsugineastem1.8229.6鹽芥籽粒Thellungiellasalsugineagrain1.6432.0

3結論與討論

近年來，水熱法合成納米微球成為關注的焦點，該方式操作簡單，合成的磁性微球粒徑均一，呈單分散性，飽和磁化強度高，更重要的是合成產率高，批間差小，這些優勢有利于產業化生產[10-13]。該研究發現，聚乙二醇的分子量如PEG2 000、PEG6 000、PEG8 000、PEG10 000對制備的Fe3O4磁性納米微球形貌、磁場中的磁響應性具有重要影響，PEG分子量的增大能獲得粒徑較小的磁性微球，但分散穩定性較差，在緩沖液中易發生團聚沉淀，對后續的應用造成困難。該研究中NaAc的用量、乙二醇的量、反應時間、反應溫度(超過或者低于200 ℃)都會對Fe3O4磁性納米微球的粒徑、形狀、磁響應性產生影響[6，11，14]。經過優化選擇，1.35 g FeCl3·6H2O配比40 mL乙二醇，使用3.6 g醋酸鈉作為還原劑、1.1 g PEG2000作為表面活性劑制備的Fe3O4磁性納米微球在5 000 T磁場下具有較好的磁響應性。

該研究運用水熱合成反應法制備的Fe3O4磁性納米微球，形貌呈球形、粒徑大小一致，分散性好，在3 000 T的磁性分離架上，30 s能夠快速分離，而且具有超順磁性，撤去磁場后能夠重新恢復到分散狀態，是用于核酸分離的理想材料。將所制備的不同濃度的Fe3O4磁性納米微球用于新疆特色植物及其植物不同部位全基因組核酸的提取，均能夠得到高產量和高純度的DNA；該試驗得到的提取所需的最適濃度為9.75 mg/mL。另外，與目前實驗室通用的CTAB法相比，應用Fe3O4磁性納米微球來提取核酸，方法簡便，耗時少，無需反復大量離心，避免多次離心過程產生的剪切力對核酸的破壞，提取的核酸產量大、純度高，可用于后續試驗如PCR、酶切、全基因組分析等。

制備Fe3O4磁性納米粒提取植物組織基因組DNA具有簡單、快速(僅需要40 min左右)、無需離心機，憑借一個簡單的磁性分離架即可完成，非常適合快速、野外、儀器設備欠缺的環境提取。然而，不同地區植物組織成分的種類、含量都會對植物基因組DNA的提取造成很大影響。因此，在提取過程中，植物組織裂解液的加入量，提取液的成分，需要根據不同植物特點和組織進行調整才能提取到完整、純度高的基因組DNA。

與傳統方法相比，該方法是一種方便、快捷且有較強通用性的基因組DNA提取方法，根據樣本的不同，整個提取過程可在30～40 min內完成。研究發現，Fe3O4磁性納米微球濃度越高，所提取的核酸產量越高，但純度越低；30 mg/mL磁性微球濃度能夠較好地保證核酸產量和純度。

綜上所述，該研究通過水熱法制備了一種粒徑均一、分散性好、飽和磁化強度高的Fe3O4磁性納米粒，以此為載體建立了一種快速、簡便提取植物DNA的方法，并選取新疆一些特色植物為樣本進行DNA提取。整個提取過程省去了多次的水浴、抽提、離心等步驟。該研究結果顯示，該方法提取的基因組DNA質量較好，可以滿足PCR等下游試驗。純化得到的DNA 可用于酶切、PCR、文庫構建、Southern雜交等試驗。該研究不僅限于對植物葉片基因組進行提取，如果更改裂解液和提取液成分還可將磁性微球應用于動物組織、真菌、細菌、病毒、質粒基因組的提取。

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基金項目石河子大學高層次人次科研啟動項目(RCZX201138)；石河子大學科學技術研究發展計劃項目(2012ZRKYQ-YD14)。

作者簡介杜鮮(1978- )，女，山西運城人，碩士研究生，研究方向：磁性納米材料制備及其生物醫學的應用。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事磁性納米材料制備及其生物醫學的應用。

收稿日期2016-03-28

中圖分類號R 318.08

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-149-04

Preparation of Magnetic Nano-microsphere by Solvothermal Synthesis and Its Application in Genomic DNA Purification from Plant Tissues

DU Xian, SUN Pei-pei, ZHANG Hong, SHI Feng*et al

(College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832003)

Abstract[Objective] The aim was to establish a method for rapidly extracting genomic DNA from several kinds of plant tissues. [Method] Fe3O4 magnetic nano-microsphere was prepared by solvothermal synthesis, the surface features of particle size, morphology, magnetic properties were analyzed. With Fe3O4 magnetic nano-microsphere as nucleic acid extraction vector, DNA of leaves, roots, stems, grains and other tissues of several kinds of Xinjiang special economic crops and plants were extracted and seperated; links of purification and seperation process were optimized. [Result] Through detection of OD260UV absorption value, agarose gel electrophoresis, the results showed that the obtained genomic DNA with high purity and integrity can meet the requirements of the downstream molecular biology operation. [Conclusion] A simple and rapid method for obtaining high yield and high quality genomic DNA from several kinds of plant tissues is established, which will provide theoretical and practical basis for automation and large-scale extraction of DNA.

Key wordsMagnetic nano-microsphere; Solvothermal synthesis; Genomic DNA; Purification; Plant tissues